干货丨合成着色剂分析之亮蓝分析有杂峰干扰？安谱实验带你揭秘真相！

食用色素，是色素的一种，即能被人适量食用的可使食物在一定程度上改变原有颜色的食品添加剂，又称食用染料和着色剂，分为天然和人工合成两种，合成着色剂因色泽鲜艳，着色力强、稳定性好、价格低廉等特点而被广泛使用。

Z常用的食品添加有新红、柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、亮蓝 、赤藓红等，《GB 5009.35-2016 食品安全国家标准 食品中合成着色剂的测定》中规定了这7种合成着色剂的液相分析方法，7种合成着色剂中其中一种着色剂是亮蓝，关于亮蓝的测定经常听实验员反馈亮蓝旁边总是有杂质峰，事实真是这样吗？

我们一起来揭秘真相！

上机标品

准备亮蓝标品， 用水配置成10ppm。

仪器条件

色谱柱： C18-Wp（4.6mm*250mm，5um）

流动相：A:甲醇B：0.02M乙酸铵

梯度洗脱：0min 20%A，5min 35% A，12~18min 98%A，20~27min 20%A

柱温：25℃

波长：254nm

进样量：20ul

流速：1.0ml/min

实验谱图

图1亮蓝色谱图（色谱条件1）

图4 亮蓝色谱图（色谱条件2）

图5 亮蓝色谱图（色谱条件3）

结果分析

扣除溶剂空白后得到的亮蓝谱图见图1，果然不是对称的色谱峰，而且非但不对称，看着还像3个峰。那么到底是什么原因呢，我们从以下方面进行了分析。

（1）标准品问题。若标准品纯度不高，可能会带来杂质干扰，查看亮蓝标准品的证书标识的纯度是87.6%，纯度不是特别高，但是是某进口知名品牌D公司生产的，无法确定3个峰里面是否含有杂质峰。

（2）光谱特征。紫外-可见吸收光谱是化合物固有的性质，一般不同的化合物其吸收特征是不一样的，因此可以通过光谱特征对化合物进行定性分析。那么这3个峰到低是什么物质呢，使用DAD检测器对其进行200-800nm范围内的扫描，得到的光谱见图2，由此可见3个化合物的紫外吸收特征非常相似，在HPLC-UV分析中这种情况一般都是同分异构体。

图2 亮蓝光谱扫描图

（3）结构特征。那么亮蓝真的有同分异构体吗，亮蓝的结构式见图3，为非偶氮类酸性染料，主要有3个同分异构体，自然界中常以 3 种同分异构体的混合物(间位磺化物:对位磺化物:邻位磺化物＝75～85: 15～20:0～8)形式存在，因而液相分析的时候常常得不到单一对称的色谱峰。

图3 亮蓝结构式

（4）定量分析。那么如何对亮蓝的含量进行定量分析是实验员比较关心的问题，液相色谱定量分析的前提是先分离，尝试对流动相比例进行调节，以减缓洗脱能力，我们发现这3个峰是可以实现基线分离的，比如图4，图5，不同色谱条件、不同浓度时各色谱峰面积结果以信息见表1。

表1 亮蓝色谱峰面积

由此可以看出，不同的色谱条件，相同浓度的亮蓝3个色谱峰基线分离和未分离时峰面积存在一定的差异，但是相同的色谱条件下，在2-100ppm的浓度范围，各个亮蓝的同分异构体峰面积-浓度的线性关系较好，可能在不同的色谱条件下，亮蓝的响应情况会有稍微的差异，而在特定的色谱条件下，亮蓝各个组分的同分异构体并不会发生很大的转变。

实验结论

（1）亮蓝分析时出现的疑似杂质峰其实是亮蓝的同分异构体，亮蓝有3种同分异构体。

（2）实际应用中可以根据自己的实验目的，决定是否要使3个同分异构体完全分离，如果测试的是总的亮蓝含量，把3个目标峰合并在一起计算，如果是计算各个异构体的含量就要通过调节色谱条件使其完全分离后再定量计算。