肿瘤筛查诊断之DNA甲基化检测

2021-12-27 00:00:00 25阅读次数

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肿瘤是影响人类健康生活的重大疾病之一，随着人类平均寿命的延长，恶性肿瘤对人类的威胁日渐增加。随着疾病谱的改变，恶性肿瘤已经成为导致死亡的主要原因之一。甲基化是蛋白质和核酸的一种重要的修饰，调节基因的表达和关闭，与癌症、衰老等许多疾病密切相关。

恶性肿瘤与肿瘤早筛

全球恶性肿瘤发病和死亡人数现状

根据世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）等发布的《2020年全球癌症数据》显示，2020年全球新发恶性肿瘤病例1929万例，死亡病例996万例，其中中国癌症新发病例456.9万例，死亡病例300.3万例，分别占全球新发与死亡病例的23.7%与30.2%。我国新发恶性肿瘤人数和恶性肿瘤死亡人数均位居全球第一。

图1. 2020年全球癌症新发病例以及死亡病例分布（数据来源于IARC，东吴证券研究所）

肿瘤早筛可显著提高患者生存率

对于肿瘤来说，目前最好的防治策略就是早筛早诊，即早筛查、早诊断、早治疗。结直肠癌是中国发病数排名前三的癌种，以结直肠癌为例，其10年疾病发展期可分为癌前病变、结直肠癌I期、II期、III期、IV期，诊断时各自的5年生存率分别为100%、91.8%、82.4%、57%和10.8%。

由此可见，肿瘤的早筛早诊对于提升患者的生存率至关重要。根据世界卫生组织数据，1/3的癌症可以通过早期发现得到治疗。

图2. 结直肠癌疾病发展期示例（引自诺辉健康招股书）

DNA甲基化与肿瘤

DNA甲基化

DNA甲基化是基因表观遗传学修饰的一种重要方式，是指在DNA甲基化转移酶（DNMT）的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将活性甲基转移至DNA链中特定碱基上的化学修饰过程。在哺乳动物中，DNA甲基化主要发生在胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（CpG）岛5′端胞嘧啶上，生成为5′甲基胞嘧啶（5-methylcytosine, m5C）。

图3.DNA甲基化（图片来源于网络，侵删）

DNA甲基化与肿瘤发生

近年来的大量研究表明，DNA异常甲基化与肿瘤的发生、发展及细胞癌变有着密切的联系，主要原因在以下几个方面：1.甲基化的CpG岛二核苷酸中的胞嘧啶以较高的频率脱氨基变成胸腺嘧啶，造成基因突变；2.抑癌基因和DNA修复基因由于超甲基化而沉默；3.癌基因甲基化水平降低而活化；4.基因组总体甲基化水平降低使转座子、重复序列活化导致染色体稳定性下降。

因此甲基化可以作为肿瘤等早期诊断的生物标记物和预后评估指标，对肿瘤的筛查和风险评估、早期诊断、分期分型、预后判断及治疗监测都具有重要的意义。

图4.肿瘤生成中的DNA甲基化改变模式（图片来源于网络，侵删）

DNA甲基化在肿瘤诊断中的应用

早筛早诊

由于细胞转化过程中的甲基化现象早于明显的恶性表型出现，甲基化研究可以用于肿瘤的早期诊断。与传统诊断方法相比，甲基化检测具有早期、无创、快捷、灵敏度高等特点。

预后判定

甲基化改变与传统的预后指标之间存在密切联系，主要包括以下四个方面：1．甲基化改变与肿瘤分级、分期有明显的相关性。2．DNA异常甲基化可促进肿瘤的侵袭和转移。3．甲基化可作为肿瘤复发的独立预测因子。4．甲基化影响生存期。

分子分型

在一个癌细胞中，可有多种基因同时被异常甲基化，每种肿瘤都有其自身一套异常甲基化基因，且某些基因异常甲基化具有肿瘤特异性。因此甲基化检测可用于肿瘤的分子分型。

DNA甲基化检测方法

随着DNA甲基化研究的不断深入，其检测方法也层出不穷。这些方法针对不同研究目的，运用不同处理方法，几乎涵盖了从基因到基因组各个层次水平的研究。

根据研究水平，这些方法大致可归为三大类：

基因组甲基化水平分析

如高效液相色谱法（HPLC）、高效毛细管电泳法（HPCE）。

候选基因甲基化分析

如甲基化敏感性限制性内切酶-PCR/Southern法（MSRE-PCR/Southern）、重亚硫酸盐测序法（Bisulfite Sequencing）、甲基化荧光PCR法(MethyLight)、甲基化特异性PCR（MS-PCR）、焦磷酸测序等。

基因组范围的DNA甲基化模式与甲基化谱分析

如限制性标记基因组扫描（RLGS）、甲基化CpG岛扩增（MCA）、差异甲基化杂交（DMH）等。

我国甲基化检测试剂盒获证情况

近几年，基于DNA甲基化位点的检测试剂盒陆续获批面世。NMPA批准的甲基化检测试剂盒均为荧光PCR法，主要原因在于荧光PCR法操作简便，无需在PCR后电泳，且具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点。

根据NMPA官网数据显示，目前甲基化检测试剂获得国家药监局注册证的国内企业有苏州为真、上海透景、博尔诚、厦门艾德、基因科技、杭州诺辉健康以及广州康立明等7家企业；甲基化检测种类涉及septin9、SHOX2、RASSF1A、RNF180、SDC2、MGMT、BMP3、NDRG4等；涉及的检测项目包括胃癌、结直肠癌、大肠癌、胶质瘤等。

表. NMPA批准的甲基化检测试剂盒

产品名称	生产厂家	注册证号
人septin9基因甲基化检测试剂盒（荧光PCR法）	苏州为真生物医药科技有限公司	国械注准20183400103
人SHOX2、RASSF1A基因甲基化DNA检测试剂盒（PCR荧光法）	上海透景生命科技股份有限公司	国械注准20173403354
RNF180/Septin9基因甲基化检测试剂盒（PCR荧光探针法）	博尔诚（北京）科技有限公司	国械注准20203400447
人类SDC2基因甲基化检测试剂盒（荧光PCR法）	厦门艾德生物医药科技股份有限公司	国械注准20213400007
septin9基因甲基化检测试剂盒（PCR荧光探针法）	博尔诚（北京）科技有限公司	国械注准20153401481
人类MGMT基因甲基化检测试剂盒（荧光PCR法）	基因科技（上海）股份有限公司	国械注准20193400101
人类SDC2基因甲基化检测试剂盒（荧光PCR法）	广州市康立明生命科技有限责任公司	国械注准20183400506
人septin9基因甲基化DNA检测试剂盒（PCR荧光法）	上海透景生命科技股份有限公司	国械注准20193400316
KRAS基因突变及BMP3/NDRG4基因甲基化和便隐血联合检测试剂盒（PCR荧光探针法-胶体金法）	杭州诺辉健康科技有限公司	国械注准20203400845

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产品类型	产品描述	产品名称	货号
探针法qPCR试剂	超高灵敏度预混液	Hieff Unicon^® Universal TaqMan multiplex qPCR master mix	11211ES
探针法qPCR试剂	超高灵敏度试剂盒	Hieff Unicon^® C64P1 TaqMan Multiplex qPCR Kit	13600ES
NGS建库试剂	甲基化DNA建库试剂盒	Hieff NGS^® Methyl-seq DNA Library Prep Kit for Illumina^®	12211ES