2023年《Journal of Extracellular Vesicle》的Z新报道！单个外泌体表征分析技术应用于外泌体的表面电荷、肿瘤源性外泌体、腺相关病毒载体等研究领域

      外泌体是包含了复杂 RNA 和蛋白质的小膜泡，是细胞间信号传输的载体。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，它们广泛存在于血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁等体液中，参与细胞间通讯。近年来，外泌体的研究热度持续攀升，已成为当前生命科学和基础医学研究的一大热点，在2023 年国家自然科学基金获批项目中，外泌体研究相关项目的总数近390个，立项的总金额突破1.5 亿元。但受限于外泌体的尺寸（30~200 nm），常规的光学显微镜无法对其进行成像分析，因此很少有技术能够对单个外泌体进行物理表征和蛋白分型。

      美国 NanoView Biosciences 公司推出的全自动外泌体荧光检测分析系统 ExoView R200系统，采用了特殊的 SP-IRIS 成像技术，只需要少量样品即可一次完成外泌体计数、粒径、蛋白表达、蛋白共定位、亚群分布的分析。全自动外泌体荧光检测分析系统   ExoView R200于 2018 年被推出后，便引起了外泌体领域科研工作者的广泛关注，目前在世界范围内已近100 多个实验室采用该技术，发表文献数百篇。本文选取了3 篇在高水平期刊《Journal of Extracellular Vesicle》（JEV）发表的比较有代表性的文章，来说明 ExoView在外泌体的表面电荷、内源性释放的肿瘤源性外泌体、腺相关病毒载体等研究领域的具体应用。

全自动外泌体荧光检测分析系统 ExoView 系统

      外泌体在生命科学系统的生理和病理过程中发挥了重要作用，但是由于其不确定性导致开发外泌体诊断方法以及治疗方法更加艰巨和复杂。早先研究证明外泌体带有负电荷，而且可通过经典方法计算外泌体的zeta 电位，但是这些研究忽略了外泌体表面紧密结合的离子的影响，低估了纳米级别的zeta电位，而且目前还未有系统地量化研究外泌体的表面电荷。Sara Hassanpour Tamrin^[3]等考虑到紧密结合的离子的影响，通过对外泌体的电泳迁移率、 zeta   电位以及价态进行关联分析来准确分析外泌体的表面电荷，这有助于开发外泌体的诊断和治疗方法。

      研究人员将实验样本分成三组，分别是从脂肪间充质干细胞 ( AMSCs )的培养上清液中提取外泌体的样本组（isolated EV   fractions），培养上清液组（culture supernatant）以及新鲜培养基组（  fresh culture medium），后两组为对照组。与ExoView芯片上 CD63 抗体结合的外泌体的荧光强度与直径的对比分析散点图显示，被捕获的样品组外泌体的平均直径为56 ± 8 nm(图 1A)。此外，研究人员通过标记外泌体相关表面标记物（CD81、CD63 和 CD9）、内容物Syntenin-1和非外泌体的细胞碎片的内质网标记物GRP94，分析了样品组颗粒的组分；ExoView 结果表明四跨膜蛋白 CD9、CD81 和 CD63 存在于样品组中（图 1B），内容物标记物Syntenin-1表达水平非常明显，而作为外泌体阴性标记物GRP94 的表达处于非常低的水平（图 1C）。另外，被CD63 抗体捕获的外泌体的蛋白共定位饼图显示样品组中存在大量共定位外泌体，这些颗粒至少表达两个或多个特异性生物标记物（图1D）。总之，这些数据证明样品组含有大量的外泌体。除此之外，样本组，培养上清液组、新鲜培养基组的共定位分析（图2A-C）阐明新鲜培养基组几乎没有共定位颗粒，而样本组的共定位颗粒比例比培养上清液组更大。

图1    ExoView检测 AMSCs样本组的外泌体的荧光强度与直径的对比、数量和进行共定位分析

图2    ExoView对 AMSCs样本组、培养上清液组以及新鲜培养基组进行共定位分析

      早前研究证明肿瘤源性外泌体（ TEV ）有助于转移前生态位（ PMN ）的形成，然而尚未有研究系统地分析 PMN 响应内源释放 TEV 形成的动力学。Laurence Blavier^[1]等在小鼠体内原位植入转移性人类黑色素瘤 ( MEL ) 和神经母细胞瘤 ( NB ) 细胞，通过 GFP 标记内源性释放的 TEV 以及它们被宿主细胞捕获，揭示了 TEV 对转移的重要作用。另外，TEV 在未来转移部位的捕获与 miR-1246 向肺巨噬细胞、肝巨噬细胞和星状细胞的转移相关。研究人员证明在PMN捕获内源性释放的 TEV 具有器官亲和性，TEV 诱导了炎症基因表达的动态变化，使其变为促肿瘤反应。

      其中，研究人员使用ExoView对从植入MEL 和 NB 的小鼠和对照组小鼠的血浆分离的外泌体进行检测，结果显示样品组中被人源 CD63、CD81、CD9抗体捕获的外泌体数量明显多于对照组，而且人源 CD63和 CD81抗体捕获的外泌体数量也明显高于CD9抗体捕获的外泌体数量，这表明样品组存在大量人源外泌体，而对照组几乎检测不到。

      腺相关病毒 (AAV) 载体在临床研究已获得多项突破，但由于难以转导肺气道细胞，AAV载体在吸入基因治疗中的临床应用仍未被破解。Gijung Kwak^[2]等研究发现与 AAV血清型6（AAV6）的标准制剂相比， AAV6 与外泌体（EV）制备的载体（EVAAV6）在原代人支气管、鼻上皮细胞以及小鼠肺气道的粘液覆盖的气液界面(ALI) 培养物中展示了明显更强的转基因表达，并且 EVAAV6 的出色功能是基于外泌体可促进粘液渗透和 AAV6 进入和转导细胞的能力。

      Gijung Kwak等使用ExoView对 EVAAV6 组和对照组中的外泌体表型进行分析。在实验中，研究人员使用四跨膜蛋白CD81、CD63、CD9的特异性抗体对样品中的外泌体进行捕获，之后用CD63、CD9、内容物syntenin-1的荧光抗体进行荧光标记。结果显示的EVAAV6 组和对照组中的外泌体在被四跨膜蛋白CD81、CD63、CD9 抗体捕获后表现出相似的syntenin-1表达水平。另外，四跨膜蛋白的 CD63、CD9 的荧光表达水平在两组中也呈现接近的趋势。总之，外泌体是 EVAAV6 组和对照组的主要组分。

图 4  ExoView 检测 EVAAV6 组和对照组的外泌体的表型和数量

      在上述 3 篇文章中，科学家借助美国NanoView Biosciences 公司研发的全自动外泌体荧光检测分析系统ExoView，直接检测样本中的外泌体，无需纯化，操作简单。一次结果直接输出外泌体粒径，绝对数目，蛋白表型，不同亚群的含量、多色荧光成像图。3 篇文章分别从外泌体的表面电荷、内源性释放的肿瘤源性外泌体、腺相关病毒载体等研究领域介绍了 ExoView 的无需纯化，全面表征的特点，有力地证明 ExoView 是外泌体检测的一大利器。

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■ 南方医科大学在《Chemical Engineering Journal 》发表文章

参考文献：
[1] Sara Hassanpour Tamrin ...& Arindom Sen. (2023) Critical considerations   in determining the surface charge of small extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles, 12:12353.
[2] Laurence Blavier ...& Yves A. DeClerck. (2023) The capture of   extracellular vesicles endogenously released by xenotransplanted tumours   induces an inflammatory reaction in the premetastatic niche. Journal of   Extracellular Vesicles, https://doi.org/10.1002/jev2.12326.
[3] Gijung Kwak ...& Jung Soo Suk. (2023) Extracellular vesicles enhance   pulmonary transduction of stably associated adeno-associated virus following intratracheal administration. Journal of Extracellular Vesicles, 12:12324.