新品│高效尿嘧啶特异性切割酶：精准清除dU碱基！

2023-09-20 00:00:00 19阅读次数

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Uracil-Specific Excision Reagent是由尿嘧啶DNA糖基化酶（Uracil DNA Glycosylase, UDG）和核酸内切酶 Ⅷ(Endonuclease VIII, Endo Ⅷ)（戳链接了解详情）两种酶混合而成。UDG识别ssDNA或dsDNA上的dU碱基并形成AP位点，但磷酸二酯骨架结构保持完整。Endo VIII的裂解酶活性能够使AP位点的3′和5′端的磷酸二酯键断裂，释放无碱基的脱氧核糖，形成单核苷酸间隙。因此，Uracil-Specific Excision Reagent（尿嘧啶-特异性切除试剂）能作用于DNA上的dU位置，产生一个单核苷酸缺口，适用于ssDNA、dsDNA及环状DNA，满足各类特异性切割dU碱基的实验需求。

图1. 切割dU碱基示意图

Uracil-Specific Excision Reagent的应用

一、RNA链特异性文库

RNA测序（RNA-seq）已成为全转录组水平研究差异基因表达和mRNA差异剪接的不可或缺工具，具有更准确、可重复、广泛和可靠的特点。RNA-seq的基本流程包括：提取RNA、建立cDNA文库、上机扩增测序、数据分析。其中RNA-seq文库构建包括常规建库和RNA链特异性建库两种方法。利用dU标记一条链，Uracil-Specific Excision Reagent使标记链被降解，可以实现链特异性RNA-seq文库构建（图2）。相比于常规RNA-seq文库，链特异性RNA-seq保留了转录本的方向信息，可以确定reads是来源于正链或负链，使得基因定量和可变剪切事件检测更准确。

图2. 常规RNA建库与链特异性文库构建对比^[1]

二、基于尿嘧啶切除的克隆

该方法依赖于含有重叠序列的PCR产物进行无缝组装，不需要依赖限制性内切酶和连接酶，可用于多个PCR片段的组装、核苷酸序列的修改以及定向克隆。

操作流程：

1、PCR引物5′端具有重叠序列，包含一个dU碱基，该碱基在与5′末端6- 10 nt距离处取代dT；
2、通过PCR在目标DNA分子和克隆载体之间生成6-10个碱基的同源性片段，并且每个PCR产物的5'端被引入了一个dU；
3、使用Uracil-Specific Excision Reagent处理PCR片段，在每个dU位置形成单核苷酸缺口，产生适合于PCR片段定向组装的3´单链延伸；
4、退火延伸完成组装。

图3. 克隆示意图

翌圣Uracil-Specific Excision Reagent

翌圣基于分子酶改造平台——ZymeEditor™，经重组表达获得高纯度、无核酸酶残留的Endo VIII（Cat#14536ES）与UDG(Cat#14455ES)，并按照一定比例混合两种酶产品，形成翌圣Uracil-Specific Excision Reagent（Cat#14537ES）。翌圣Uracil-Specific Excision Reagent无核酸酶、RNase残留，与进口品牌N*的切除效果一致。

数据展示

与进口知名品牌N*的切除效果一致

分别使用翌圣的Uracil-Specific Excision Reagent（1 U/μL）与进口品牌N*的同类产品（1 U/μL）催化10 pmol双链DNA，琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，翌圣Uracil-Specific Excision Reagent与进口品牌N*的碱基切除效果一致（图4）。

图4. 切除效果对比

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应用	产品名称	产品货号
基于尿嘧啶切除的克隆、 RNA链特异性建库	Uracil-Specific Excision Reagent(1 U/μL)	14537ES
DNA损伤修复研究	Endonuclease VIII (10 U/μL)	14536ES
PCR防污染	Uracil DNA Glycosylase (UDG/UNG), 1 U/μL	14455ES