阿尔玛蓝（Alamar Blue）在细胞增殖中的应用

产品介绍

阿尔玛蓝（Alamar Blue）是一种氧化还原指示剂，能根据代谢活性产生吸亮度变化和荧光信号。这是一种安全无毒的染料，可用于细胞活性和细胞增殖的定量分析以及细胞因子生物测定和体外细胞毒性研究，能有效测定动物、真菌和细菌细胞的天然代谢活性。

技术原理

Alamar Blue在氧化状态下呈现紫蓝色无荧光性，而在还原状态下，转变为呈粉红或红色荧光的还原产物，反映所研究的细胞或微生物对氧分子的消耗，因而常被用作氧化还原指示剂，以显示被观察细胞和细菌的代谢活动。

这种测定是基于具有代谢活性的细胞将试剂转换成荧光和比色指示剂的能力。在细胞增殖过程中，细胞内NADPH/NADP、FADH/FAD、FMNH/FMN和NADH/NAD的比值升高，处于还原环境。摄入细胞内的染料被这些代谢中间体及细胞色素类还原后释放到细胞外并溶于培养基中，使培养基从无荧光的靛青蓝变成有荧光的粉红色。受损和无活性细胞具有较低的天然代谢活性，因此对应的信号较低。可以用普通分光光度计或荧光光度计检测，其激发光波长在530-560 nm之间，发射光波长为590 nm。吸光度和荧光强度与活性细胞数成正比。

产品特点

本品可广泛地用于细胞增殖代谢，药物的细胞毒作用的体外测定以及病原微生物的的快速检测与鉴定。 与台盼兰、TTC、MTT、MTS等分析法相比，Alamar Blue具有更多的优势。Alamar Blue采用单一试剂，可以连续、快速地检测细胞的增生状态。由于Alamar Blue对细胞无毒、无害，不影响细胞的抗体合成与分泌等活性，因此可以对同一批细胞的增生状态进行连续观察和进一步的实验观察，因此有操作简便和几乎不干扰细胞正常代谢的特点。 

运输与保存方法 

冰袋运输。4ºC避光保存，一年有效。

使用方法

一、制作标准曲线（测定最佳孵育时间和细胞数量）

1、每孔加入100微升细胞悬液（对数生长期细胞），对细胞计数。按比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5个细胞浓度梯度，每个浓度建议3-6个复孔。

注：设置阴性对照：细胞培养基中不加入细胞；阳性对照：100微升100%还原型Alamar Blue（不含细胞）。

2、每孔加入10微升Alamar Blue。阳性对照孔中加入10微升无菌的超纯水。

3、放入细胞培养箱内培养（37℃,5% CO2）一定时间。培养基的颜色由靛青蓝开始变成粉红色就可以进入下一步。

4、绘制标准曲线。

二、细胞毒性和细胞增殖检测

1、每孔加入100微升细胞悬液（对数生长期细胞），对细胞计数。建议细胞数量为10⁴/mL，具体每孔需要的细胞数量，需根据细胞类型决定。

2、 细胞中加入待检测药物，为检测药物对细胞增殖的作用，请设置合适的对照组，包括刺激细胞和非刺激细胞。

3、混匀，放入细胞培养箱内孵育（37℃，5% CO₂）一段时间。

4、每孔加入10微升Alamar Blue。阳性对照孔中加入10微升无菌的超纯水。

5、放入细胞培养箱内孵育（37℃，5% CO₂）4 - 8 h，最佳孵育时间取决于细胞类型。培养基的颜色由靛青蓝开始变成粉红色就可以进入下一步。

6、推荐用荧光分光光度计检测，激发光波长在530-560 nm之间，发射光波长为590 nm。

7、普通分光光度计在570nm测定吸光度，参考波长600 nm。也可用570/630 nm和540/600 nm替代。

常见问题

Q：还原率的计算其中一步是还原型阳性对照荧光值减去阴性对照的荧光值，减去后成负值？

A：阳性对照的值比实验组高，需要重新制备。阳性对照是100%还原的，高温使得阿尔玛蓝变成还原态的。

Q：Alamar Blue 阿尔玛蓝,使用是需要高压灭菌是吧?

A: 阿尔玛蓝本身是无菌的。只有制备还原型的时候需要灭菌。不能对浓缩的Alamar Blue高压灭菌。

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