本生阐述：牛血清白蛋白的应用

　　本生阐述：牛血清白蛋白的应用

　　牛血清白蛋白(BSA)在生化实验中有广泛的应用, 例如在WB实验中加入BSA, 通过提高溶液中蛋白质的浓度，对酶起保护作用。防止酶的分解和非特异性吸附，能减轻有些酶的变性，减轻不利环境因素如加热，表面张力及化学因素引起的变性的。具体的WB实验操作和BSA在实验中的应用分享如下

　　方法/步骤

　　测定蛋白浓度

　　按50：1配置BCA工作液。10ulC液(蛋白标准)+90ulPBS液稀释成0.5mg/ml的蛋白标准液。再分别以0、1、2、4、8、12、16、20ul将蛋白标准液加入96孔板的第1~8标准孔中，在其他样品孔中加入10ul待测样品。分别加PBS定容至20ul。各孔中加入200ulBCA工作液，室温放置2小时。用酶标仪测定蛋白浓度：测定A562，依标准曲线算出蛋白浓度。

　　SDS-PAGE电泳

　　1 制 胶: 按比例配制分离胶，缓缓地摇动溶液，使激活剂混合均匀，将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水，以阻止氧气进入凝胶溶液中，静置40min。同前按比例配制浓缩胶，但混匀溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，连续平稳的注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡，静制60min以上以保证完全聚合。

　　2 预电泳： 将聚合好的凝胶安置于电泳槽中，小心拔去梳子，加入电泳缓冲液后低电压10-20V的预电泳20-30min。(目的是清除凝胶内的杂质， 疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通)。

　　3 样品准备：首先计算上样体积，然后按样品：上样buffer=4：1的比例加入上样bufer混匀，沸水煮10分钟，冰上5分钟。

　　4 加 样： 预电泳后依次加入标准品(Marker)和待分析样品。(加样时间要尽量短，以免样品扩散，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液避免边缘效应。每个泳道加5ul 。

　　5 电 泳： 加样完毕，选择80V恒压进行电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿到达两胶交界处(一般约20分钟)，更换至100V恒压电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳(一般约为1小时20分钟)。

　　膜的封闭

　　用TBST液洗涤印迹膜10分钟x2次。放入5%BSA(abs49001012)封闭液内，摇床震动，70转/分钟，室温封闭1小时30分钟。

　　蛋白质的样品制备

　　取心肌组织50mg，待组织块自行溶解，用滤纸吸去其表面水分，将组织块放入玻璃匀浆器球状部位，用组织剪尽量将其剪碎，将剪碎的心肌组织放入玻璃匀浆器的杆状部，按1mlRIPA+10ulPMSF/100mg心肌组织的比例加入RIPA和PMSF(先加RIPA再加PMSF)，将玻璃匀浆器插入冰中，匀浆约30分钟。

　　将心肌组织匀浆转移到离心管中，4℃12000g离心5分钟，收集上清(如有粘稠物进一步用超声处理)，样品分装冻存于-20℃备用。

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