蛋白纯化小白如何快速进阶成大神 | 研习社有招

Superdex 200 Increase 10/300

又超压报警了？

两个分子量相当的蛋白想分离

又苦于无计可施？

…

这些场景你是否似曾相识？

没关系

你有问题，我有答案~

   Cytiva开学狂欢季系列活动之

研习社开张啦！

【DY期 蛋白纯化专场】

欢迎大家说出你的问题

我们已准备接招！

Q：Superdex200 Increase 10/300堵了、超压如何处理？

A：建议参考说明书CIP操作进行清洁 (NaOH溶液一般是Z有效的清洁剂)；同时也建议更换层析柱顶端滤膜或超声清洗；必要时移除层析柱顶端2-3 mm凝胶，调节adaptor消除顶端死体积。

Q：如何去除样品中的DNA/RNA等核酸杂质污染？

A：a.延长超声时间以降低粘度。也可以使用核酸酶如Benzonase同时消化DNA和RNA。如果来源是大肠杆菌裂解液，含有大量的DNA，可以用链霉素沉淀等方法，预先去除大量的 DNA。

b.通过层析方法去除：由于核酸带负电，在阴离子柱上会结合或阳离子柱上流穿，也可有效去除核酸。

Q：洗脱得到的His标签蛋白样品的杂带较多纯度不高，应如何改进？

A：a.杂蛋白对于金属离子也有较强的结合：优化结合、洗脱条件；尝试不同金属离子螯合的填料 (例如Co2+：HiTrapTALON crude预装柱和TALON Superflow填料)；增加后续的纯化步骤，例如离子交换、凝胶过滤等等；构建双标签蛋白进一步纯化。

b.杂质与目的蛋白存在相互作用而共洗脱：在细胞破碎前加入去垢剂或还原剂，提高Wash buffer中去垢剂浓度(2% TritonX -100或2% Tween -20)或添加甘油 (20%以内)以破坏非特异性相互作用，HiTrap excel预装柱和Ni Sepharose excel填料将大大简化操作步骤。

Q：抗体平台正在工艺开发阶段，想要快速GX的Protein A填料？

A：a.2018年上市MabSelect PrismA，耐受0.5-1 M NaOH，并且配基长度、密度以及基架孔径和孔隙率等均经过优化，具有高耐碱和高载量的特点。

b.2020年，Cytiva推出新品HiTrap/

HiScreen Fibro PrismA，采用衍生的静电纺丝纤维素为基质，传质受对流流速控制，保留时间以秒而非分钟计算，在数分钟内即可完成一次实验循环。

Q：我的靶蛋白与杂质蛋白仅相差几个氨基酸，该如何分离？

A：分子量仅相差几个氨基酸的蛋白分子是比较难分离的，我们建议优先尝试高分辨率离子交换预装柱：Capto HiRes Q或Capto HiRes S系列，同时减少上样量并且拉大洗脱梯度进行优化。

Q：使用注射器手动操作HiTrap柱子进行样品纯化，如何控制流速？

A：1 ml/min = 在HiTrap 1 ml柱子上近似30滴/min；

5 ml/min = 在HiTrap 5 ml柱子上近似120滴/min。