应用丨使用离心分配色谱法（CPC）从连翘中纯化连翘脂苷A

连翘Forsythia suspensa (Thumb.) Vahl.，是一种在中国、韩国和日本被广泛用于治疗淋病、丹毒、炎症、发热、溃疡和其他疾病的传统药物。1 连翘脂苷A是一种苯乙醇糖苷，是从连翘风干果实中提取的主要活性成分之一(图 2)。据报道，其具有广泛的药理作用，包括消炎和抗氧化活性。2  

连翘苷A的相关研究需要大量的标准品。科学家们一直在寻找一种简单有效的方法来分离这种有效化合物。在过去，常使用开口(低压)柱色谱法，但这导致了很高的时间和溶剂成本。现在，使用离心分配色谱(CPC)技术可以Z大限度地降低这些成本。 

CPC是一种无需基质的全液分配色谱，无不可逆吸附，样品回收率高，样品载量高，可直接从实验室规模放大到工业规模。3 本文介绍了使用CPC 对连翘脂苷A进行分离纯化的方法。

Gilson VERITY? 实验级离心分配色谱系统, 由

CPC 250 离心分配色谱和PLC 2050 纯化色谱系统组成。PLC 2050 纯化色谱系统包括一个50 mL/min 的四元梯度泵，UV/VIS检测器，馏分收集器以及Gilson Glider 控制软件（图 3）。 

将连翘果实经 100%甲醇处理的提取物悬浮于水中。水溶液在二氯甲烷、乙酸乙酯(EtOAc)和水饱和正丁醇(n-BuOH)之间进行分配。将正丁醇馏分冷冻干燥后用于CPC纯化。 

本应用选择使用Yang M. et. 1 发表的溶剂体系进行实验级测试。将乙酸乙酯-正丁醇-甲醇-水 (4:0.5:0.5:5,v/v)的混合物在分液斗中摇晃，并在室温下分离。上层相作为固定相，下层相作为流动相。连翘果实的正丁醇馏分分次(第1次1 g，第2次3 g;第3次2.85 g)溶解于4 mL溶剂混合物(溶剂体系为上相2 mL，下相2 mL)中，并用PTFE滤器(疏水膜；直径:13mm，孔径:0.45 μm)进行过滤。

以30 mL/min的流速将固定相充满250 mLCPC 系统，转速保持在500 rpm。然后将下相以8 mL/min 的流速泵入柱中，转速设置为1800 rpm。达到流体动力学平衡后，将样品(4ml)注入进样阀。在254 nm、280 nm和330 nm波长下对流出液进行监测，并根据330 nm光吸收收集馏分(表1)。 

表1  离心分配色谱（CPC）纯化条件

对CPC中收集的馏分进行HPLC分析，HPLC条件如表2所示。

CPC溶剂体系确定后，分别在CPC 250-PLC 2050 系统上进行三次进样（分别为1g、3g 和2.85g 样品）。图4为第一次进样(1g)的色谱图。表3为三次进样合并收集馏分后的产量，馏分根据各自色谱图连翘脂苷A的峰图进行合并。从6.85 g合并的粗正丁醇馏分中，共得到连翘脂苷A 1.96 g，占总进样量的28.61%。

图4  连翘果实正丁醇馏分（1g进样量）的CPC色谱图。馏分11-16进行了合并，干燥和称重 

表3  连翘脂苷A的产率

图5显示了使用表2所述条件对第1批进样所收集馏分11-16进行HPLC分析。从图中可以看出，馏分11-16的纯度为94.56%。

图5  CPC第1次进样所得馏分11-16 的HPLC色谱图

参考文献：

1.Yang M., Xu X., Xie C., Huang J., Xie Z. and Yang D. Isolation and purification of forsythoside A and suspensaside A from Forsythia suspensa by high speed countercurrent chromatography. J.Liq.Chrom.Relat.Tech., 36, 2895-2904 (2013). 

2. Ma T, Shi YL and Wang YL: Forsythiaside A protects against focal cerebral ischemic injury by mediating the activation of the Nrf2 and endoplasmic reticulum stress pathways. Mol. Med. Rep., 20, 1313-1320 (2019).

3. Hostettman K., Marston A., Hostettman M. Preparative Chromatography Techniques: Applications in Natural Product Isolation, Springer, Berlin, 1998.