中药材连翘的功效又添新的科学证据了——连翘酯苷E通过靶向PKM2四聚化促进巨噬细胞M2极化以减轻肝损伤

前言

方法概述

作者结合动态光散射（DLS）和荧光共振能量转移（FRET）技术构建的突变蛋白模型显示，FE通过结合PKM2的K311位点促进四聚体形成。利用海马XF代谢分析仪、实时单细胞多模态分析系统及转录组测序技术，研究揭示FE介导的PKM2四聚化可诱导巨噬细胞代谢重编程，同时抑制STAT3磷酸化及后续NLRP3转录激活。体内评估表明FE未表现出显著多器官毒性。FE通过促进巨噬细胞向M2抗炎表型极化，缓解脓毒症诱导的肝损伤。通过在小鼠中过表达巨噬细胞特异性PKM2 WT/K311A突变体，进一步验证了FE的作用机制。我司产品实时单细胞多模态分析系统直接在单细胞水平分析了巨噬细胞经过FE处理后，单个细胞内乳酸含量变化水平（详见图6）

图1.PKM2加剧脓毒症诱导的肝损伤。A) 使用GEO 2R在数据集GSE57065中分析正常个体与脓毒症患者PKM2基因表达。B) GSE166488数据集中差异表达基因的热图。C) GSE166488数据集中差异表达基因的火山图。D) GSE166488数据集中差异表达基因的KEGG 通路富集分析。E) 对照组与LPS处理小鼠肝脏组织中的巨噬细胞浸润情况。F) 小鼠肝脏组织中PKM2 mRNA表达与Adgre1 mRNA表达的相关性。G) 对照组和LPS处理组小鼠肝脏组织中M1和M2巨噬细胞的浸润。H)I) GSE254497数据集的UMAP 分析。J)火山图

图2.高通量虚拟筛选寻找变构激活剂。A) 对照组（Ctrl）、CLP组和LPS处理组小鼠肝脏组织中PKM2及磷酸化PKM2（p-PKM2）蛋白的表达情况。B) 针对PKM2激动剂结合位点的虚拟筛选流程示意图。C) 前四位候选化合物的名称、CAS号及分子对接评分。D) 四种化合物与PKM2的分子对接构象。

图3.FE是一种潜在的变构激活剂。A)通过MTT 法评估四种化合物对RAW264.7细胞的细胞毒性。B)经四种化合物处理的RAW264.7细胞中PKM2多聚体的DSS交联分析。C)经FE（12.5、25、50 μm）或DA（DASA -58、20 μm）处理的LPS诱导巨噬细胞中PKM2多聚体的表达。D)LPS诱导的RAW264.7细胞中炎症相关蛋白（iNOS、COX2、IL-1 β ）的Western blot分析。E)经FE处理的LPS诱导RAW264.7细胞中M1（CD86、TNF -α、IL-1 β ）极化标志物的mRNA表达。G)经FE处理的LPS诱导RAW264.7细胞中M2（CD206、IL-10、ARG1）极化标志物的mRNA表达。F)通过流式细胞术检测细胞表面CD86和H)CD206的表达。I)FE处理的RAW264.7细胞中PKM2在胞质和细胞核中的免疫荧光定位。J)RAW264.7细胞胞质和核组分中PKM2表达的Western blot分析。K)不同细胞中PKM2四聚体蛋白的表达水平。

图4.FE直接靶向PKM2。A)两种FE探针的化学结构。B)靶标捕获实验示意图。C)FE-生物素靶标捕获的银染结果。D)FE-生物素捕获中PKM2蛋白的质谱鉴定。E)FE-生物素捕获中PKM2蛋白的Western印迹验证。F)FE-PLA靶标捕获的银染结果。G)FE-PLA捕获中PKM2蛋白的质谱鉴定。H)FE-PLA捕获中PKM2蛋白的Western印迹验证。I)FE-生物素与PKM2蛋白的免疫荧光共定位。J)不同探针对iNOS蛋白表达的抑制效果。K) PKM2蛋白热稳定性CETSA 分析。L)PKM2蛋白表达的darts分析。M)FE与PKM2蛋白结合亲和力的SPR分析。N) RMSD 和O)通过分子动力学模拟分析PKM2四聚体Apo（蓝色）与PKM2四聚体+FE（红色）的稳定性。

图5.FE直接结合PKM2的K311位点。A)使用ESPript 3.0进行的PKM2蛋白序列保守性分析。B)PKM2蛋白序列保守性的Consurf分析。C)FE与PKM2重组蛋白相互作用的CETSA 分析。D)293T细胞中PKM2多聚体的DSS交联分析。E)原子力显微镜力谱分析示意图。F–H)PKM2野生型与K311A重组蛋白的力谱分析。I)FE与PKM2野生型的MST分析。J)FE与PKM2 K311A的MST分析。K)PKM2野生型颗粒尺寸的动态光散射分析。L)PKM2 K311A颗粒尺寸的动态光散射分析。M)PKM2野生型聚集的FRET分析。N)PKM2 K311A聚集的FRET分析。O) RMSD 和P)通过分子动力学模拟分析PKM2四聚体K311A+FE（绿色）与PKM2四聚体+FE（红色/蓝色）的稳定性。

图6.FE促进巨噬细胞代谢重编程。A) FE抑制巨噬细胞糖酵解的假说。B) 单细胞注射前后的细胞形态变化。C) 细胞内乳酸含量的单细胞分析。D) 糖酵解相关蛋白的mRNA表达。E–G) ECAR 检测数据（包括基础和代偿性糖酵解水平）。H) RAW264.7细胞的葡萄糖摄取。I) RAW264.7细胞的乳酸分泌。J–L) OCR检测数据（包括基础呼吸和最大呼吸）。M) RAW264.7细胞线粒体膜电位的JC1染色分析。N) RAW264.7细胞线粒体形态的线粒体追踪器分析。

图7.FE抑制STAT3/NLRP3信号通路。A) FE抑制PKM2激酶功能的假说。B) GSE166488数据集中IL6-JAK-STAT3通路的GSEA 分析。C) RAW264.7细胞中P-STAT3蛋白的表达。D) 细胞质与核组分中P-STAT3表达的Western blot分析。E，F) STAT3与PKM2相互作用的免疫共沉淀分析。G) P-STAT3与PKM2的免疫荧光共定位。H) FE处理组与LPS诱导组RAW264.7细胞差异表达基因的火山图。I) 差异表达基因的KEGG 通路富集分析。J) FE处理组与LPS诱导组RAW264.7细胞IL-6-JAK-STAT3通路的GSEA 分析。K) RAW264.7细胞中NLRP3的mRNA表达。L) RAW264.7细胞中炎症相关蛋白P-STAT3与NLRP3的Western blot分析。

图8.肝脏与血液中氟乙酰胺（FE）的分布情况，未观察到器官毒性。A、B）实验设计概述；C）氟乙酰胺标准品质谱分析结果；D）血清样本检测结果；E）肝脏组织样本检测结果；F）肝损伤指标检测结果；G）肾损伤指标检测结果；H）胰腺损伤指标检测结果；I）心脏损伤指标检测结果；J）肝脏HE染色结果；K）肾脏HE染色结果。

图9.FE缓解脓毒症诱导的小鼠肝损伤。A)动物实验流程图。B)体重变化的统计结果。C)小鼠肝脏组织的外观及HE染色。D)小鼠血清中ALT和AST的表达。E)小鼠肝脏组织中CD86（M1标志物）和CD206（M2标志物）的IHC 分析。F)小鼠肝脏组织中M1巨噬细胞标志物（TNF -α、IL-1 β 、CD 86）的mRNA表达。G)小鼠肝脏组织中M2巨噬细胞标志物（CD206、IL-10、Arg1）的mRNA表达。H)小鼠肝脏组织中糖酵解相关蛋白（LDHA 、Glut1、HK2）的mRNA表达。I)小鼠肝脏组织中NLRP3的mRNA表达。J)肝脏中丙酮酸激酶活性的检测。K)小鼠肝脏组织中炎症相关蛋白、p-STAT3和NLRP3的Western blot分析。

图10.靶向巨噬细胞中PKM2 K311的FE治疗可缓解脓毒症诱导的肝损伤。A）动物实验流程图。B）小鼠肝脏组织外观。C）肝脏组织免疫荧光染色。D）小鼠血清中ALT和AST表达。E）小鼠肝脏组织HE染色。F）小鼠肝脏组织透射电子显微镜观察结果。G）肝脏中丙酮酸激酶活性检测。H）小鼠肝脏组织炎症相关蛋白、p-STAT3、NLRP3、前半胱天冬酶1及裂解半胱天冬酶1的Western blot分析。I）小鼠肝脏组织糖酵解相关蛋白（LDHA 、Glut1、HK2）mRNA表达。J）小鼠肝脏组织M1型巨噬细胞标志物（TNF -α、IL-1 β 、CD86）mRNA表达。K）小鼠肝脏组织M2型巨噬细胞标志物（CD206、IL-10、Arg1）mRNA表达。L）小鼠肝脏组织CD86（M1标志物）和CD206（M2标志物）的IHC 分析。

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