Milo：心肌细胞分化追踪，干细胞ZL质控利器

       心脏一旦受损，几乎无法再生，这意味着心脏严重缺乏心肌细胞的更新，导致心脏功能的下降，进而引发心力衰竭（HF）等疾病。在这种情况下，可采用心脏移植的方式对患者进行ZL。但供体心脏的短缺严重阻碍了这一ZL的进程，同时也给国家卫生机构带来了经济负担。为了解决这个问题，需要开发新的替代方法作为潜在的ZL方案。

       源自人类诱导的多能干细胞（hiPSC）的心肌细胞（CM），为ZL和建模心血管疾病（CVD）提供了一种新颖而有前途的再生策略。基于Yamanaka等科学家的开创性工作，研究人员现在可以从各种来源生成hiPSC，然后将hiPSC分化为心肌细胞^1,2。但是与天然（体内）成人CM相比，实验室培养的人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞（hiPSC-CM）的成熟状态，分子表达谱和功能可能有所不同，从而限制了其实用性和一致性。为了充分发挥其再生ZL的潜力，必须对hiPSC-CM培养物进行严格表征3。

       单细胞谱分析技术可以对hiPSC-CM的异质性进行准确的分析。基于Milo™Single-Cell Western，具有区分细胞间蛋白质表达和细胞身份差异的分辨能力，可以表征细胞标志物的异质性，同时可以监控hiPSC细胞分化为CM细胞的分化过程，并对Z终心肌细胞进行质量检测。

技术流程

hiPSC细胞分化为心肌细胞

Milo操作流程

       将细胞悬浮液加载到scWest芯片上，这样单个细胞就可以安放在芯片上的各个微孔中。然后Milo裂解细胞，产生单细胞裂解物，通过分子量电泳分离每个单细胞裂解物中的蛋白质，然后使用紫外线在scWest芯片中捕获蛋白质。然后，对目标蛋白进行一级抗体和荧光二级抗体进行免疫荧光捕获。通过使用开放格式的微阵列扫描仪对芯片进行成像，并使用Scout™软件对图像进行分析，以进行定量的自动数据分析。

实验结果

鉴定hiPSC细胞

监测心肌细胞的分化（第0天，第21天）

监测分化为不同细胞表型（心房和心室）的比例

结论：

       hiPSC-CM在基础和转化心脏研究中的应用，可以更好地了解心血管疾病，以及发现和开发心血管疾病的ZL药物。然而，大量样品的分析不能提供足够的分辨率，来表征诱导多能干细胞或hiPSC-CM细胞亚群的分子异质性，以及hiPSC-CM成熟过程中蛋白质表达的波动。

       ProteinSimple Milo™的Single-Cell Western，可以实现单细胞蛋白表达的分辨率分析，从而确定细胞亚群的异质性。在这项研究中，展示了Milo™对hiPSC和hiPSC-CM样本进行单细胞谱分析的能力，以及跟踪细胞分化表型的能力。且这项技术将提高心肌细胞生产的一致性，并加速开发强大的干细胞疗法。

参考文献：

1.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblasts cultures by defined factors, K Takahashi and S Yamanaka, Cell, 2006; 126:663.

2.Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors, K Takahashi, K Tanabe, M Ohnuki, M Narita, T Ichisaka, K Tomoda, and S Yamanaka, Cell, 2007: Cell 131:861.

3.Defining human cardiac transcription factor hierarchies using integrated single-cell heterogeneity analysis, JM Churko, P Garg, B Treutlein, M Venkatasubramanian, H Wu, J Lee, QN Wessells, SY Chen, WY Chen, K Chetal, G Mantalas, N Neff, E Jabart, A Sharma, GP Nolan, N Salomonis, and JC Wu, Nat. Commun., 2018; 9:4906.

4.Cardiomyocyte differentiation of pluripotent stem cells and their use as cardiac disease models, C Dambrot, R Passier, D Atsma, CL Mummery, Biochem J, 2011: 434:25.

5.Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. MA Laflamme, KY Chen, AV Naumova, V Muskheli, JA Fugate, SK Dupras, H Reinecke, C Xu, M Hassanipour, S Police, C O’Sullivan, L Collins, Y Chen, E Minami, EA Gill, S Ueno, C Yuan, J Gold, CE Murry, Nat. Biotech, 2007; 25:1015.

6.Characterization and enrichment of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. C Xu C, S Police, N Rao, MK Carpenter, Circ. Res., 2002; 91:501.