如何提高脊髓组织冰冻切片质量？

当同时需要取脊髓和背根神经节（dorsal root ganglion,DRG）时，应先取出脊髓再取背根神经节，以防取背根神经节时牵拉破坏脊髓完整性。

由于DRG胞体位于椎间孔中，从椎间孔中夹取DRG时应小心，勿损伤胞体。部分大鼠DRG脊髓远端神经纤维较为粗壮，可用止血钳夹住肌肉中暴露的神经纤维，将DRG胞体一起抽出。取出的DRG可以保留2-3 mm的神经纤维，方便后续实验夹取，避免夹持损伤胞体结构。

必须在取材时保证脊髓和DRG的完整性，后续才能切除完整无裂隙的组织切片。

1. 一般选择4%的多聚甲醛在4℃下进行固定，多聚甲醛的质量分数越大，固定时间越久，对组织的固定收缩作用越强，对组织的损伤越大。

2. 随着脊髓组织固定时间的延长，其抗原表达下降，尤其是脊髓前角。

3. 若取材时PFA灌注不完全，可将取出的脊髓组织浸泡在PFA中4-6小时，但勿超过24小时，否则容易产生结晶，破坏后续染色效果。

4. 为保证固定质量，固定液的量应该保证充足。

脊髓组织是含水量较大的生物组织，为了防止冰冻切片过程中产生冰晶破坏组织结构，通常会使用蔗糖进行梯度脱水，常用15%、20%、30%的蔗糖进行脱水。

使用梯度蔗糖脱水的过程又称为沉糖，这是因为一开始将脊髓放入蔗糖中，脊髓通常会漂浮在蔗糖上层，随着时间的推移，高浓度的蔗糖会将脊髓中的水分析出，脊髓浮力降低Z终沉至试管底。因此当脊髓沉底时，便可更换更高浓度蔗糖进行下一步脱水。

包埋前将脊髓和DRG从蔗糖溶液中取出，用吸水纸吸干表面残留水分。

冰冻切片通常都采用OCT（一种聚乙二醇和聚丙烯酸甲酯的混合水溶液）对组织进行包埋。包埋可直接在样品托上放置组织样品然后滴加包埋剂，也可以使用包埋盒底膜对组织进行包埋。

对于实验新人，选择合适尺寸的包埋盒底膜可以有效控制包埋剂的用量。对于小鼠脊髓和DRG推荐使用7 x 7 x 5 mm的包埋盒底膜，对于大鼠脊髓和DRG推荐使用17 x 17 x 5  mm的包埋盒底膜，对于更大动物的脊髓和DRG可选用更大尺寸的包埋盒底膜。

包埋DRG时，可以先在包埋盒底膜铺一层包埋剂，待包埋剂快冻实前，将DRG有序地摆放在包埋剂之上，然后再在上层铺满包埋剂。这样能够使切片时多个DRG胞体处于同一平面，避免后续切下的一张片子上仅有1、2个胞体，而不利于后保持染色条件的一致和数据统计。

为了减少脊髓和DRG组织在速冻过程中冰晶的产生，可以采用干冰、液氮等耗材对包埋的样品进行速冻，也可以使用具有速冻功能的冰冻切片机对其进行速冻。

瑞沃德冰冻切片机速冻台平均温度-42℃，同时还有装配帕尔贴的两个快冷点，开启速冻功能后2个快冷点在2分钟内可降温至-60℃。近80℃的温差，可以使组织快速跨越冰冻点，有效减少组织中的冰晶产生。

脊髓和DRG组织的Z佳切片温度为-15~-18℃，使用双制冷冰冻切片机时，样品头制冷能够更好保证组织样本处于Z佳切片温度，达到Z佳切片效果。由于环境温度不同、切片机品牌的不同，实际的Z佳切片温度会有所差异。

脊髓和DRG组织的Z佳切片厚度因实验动物和后续染色实验的不同而异。一般大小鼠脊髓切片厚度范围10-30 μm，DRG的厚度为8-20 μm。实验中具体的切片厚度推荐参考优秀期刊论文中厚度。

切片时若发现切片卷曲严重，可裁去组织周围空白包埋剂的，同时减少包埋剂也能减少贴片皱褶。

对于脊髓和DRG组织这类较小的组织，贴片时不易产生气泡或皱褶，可用室温玻片直接粘附冰冻切片。贴片易于保持脊髓组织的完整性，后续染色洗涤简便，但染色效率较低。DRG组织由于体积小，只能选用贴片的方式。

除了贴片外，脊髓组织还可以采用漂片的方式收集切片样本。使用漂片法时，用镊子夹取脊髓冰冻切片直接放入PBS溶液中即可。对于免疫组组化和免疫荧光来说，漂片法染色效率更高，出结果相对容易，但抗体消耗量大，且在后续染色实验过程中容易出现组织破碎，裱片困难，对操作人员的熟练度要求较高。