NAT (Q-PCR) | 支原体快检、方法验证和检测服务

近年来，随着生物医药迅猛发展以及基因细胞治疗领域研究的深入，如何把控生物制品安全可靠，成为各国法规政府重视以及监管的要点。因为支原体是一种比较常见但通常难以去除的污染类型，所以对于涉及细胞培养的生物制品工艺过程，法规要求“都必须确保无支原体污染”。

在快速检测方法（NAT，核酸扩增技术）出现之前，传统的培养法和指示细胞法因其检测周期长或灵敏度问题，致使企业生产或产品放行周期拉长或者需要基于风险评估对细胞原料进行条件放行或者寻求其他替代方法。而随着细胞基因治疗的发展，行业内对支原体检测时效性和灵敏度要求越来越高，短的货架期不足以支撑如此长的检测周期，因此NAT方法从众多支原体检测方法中脱颖而出。

目前欧洲药典（EP）<2.6.7>，日本药典（JP）以及美国药典（USP）<63>都已收录NAT方法作为支原体检测方法，但需要对该方法进行验证以及与传统方法进行对比其检测灵敏度不低于传统方法，才可以使用。2020版中国药典（ChP）虽然并未收录NAT法作为支原体检测方法，但其中也提到了“也可采用经国家药品检定机构认可的其他方法”。2022年5月，国家药监局药审中心发布的《免疫细胞治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》中提到“当检验样品量有限，或需要快速放行等特殊情况下，如药典方法无法满足，可考虑开发新型的无菌和支原体的检测方法进行放行检测，但是新型检测方法应经过充分验证”。所以NAT法有望作为能够支持快速支原体放行检测的方法，被越来越多的原材料供应商、以及ATMP企业所使用。

对于如何进行NAT方法的验证，目前欧洲药典<2.6.7>和日本药典里都详细介绍，其内容基本一致。中检院也发表了文章《支原体检查的核酸检测方法及方法学验证的思考》，以期对我国支原体核酸扩增法检测的研发者及使用者提供借鉴。支原体NAT法须进行专属性（Specificity）、检测限（Detection Limit）和耐用性（Robustness）验证。如果使用商业化试剂盒进行支原体检测，则可以基于供应商的完整试剂盒性能验证报告再结合本身实验室环境和样品类型进行合适的方法适用性验证。

翌圣生物商业化支原体快检试剂盒(NAT，qPCR法)

MycAway™支原体qPCR检测试剂盒(探针法)是基于NAT的一种快速定性检测生产原料、细胞库、病毒种子、病毒或细胞收获液、治疗用细胞中潜在支原体污染的产品。该试剂盒基于定量PCR技术，使用Taqman荧光探针定性检测待测样本中支原体DNA，可覆盖160多种支原体DNA序列；并且严格按照EP 2.6.7和JP G3支原体检测相关指南和要求进行验证，具备灵敏度高、特异性好、安全性好等特点。

它能够与MolPure® 磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒搭配使用，可以通过手动提取或者使用Auto-Pure 32A全自动核酸提取仪自动提取样本核酸。样本经过前处理去除干扰杂质获得纯化的支原体DNA后，通过qPCR收集探针的荧光信号，从而对检测结果进行判定。

根据EP 2.6.7和JP XVII G3中的要求，用户在使用商业化试剂盒进行支原体检测时，除了可以使用试剂盒供应商提供的试剂盒性能验证数据之外，还需要根据本身实验环境和条件并针对自己的样品，进行支原体检测方法的方法适用性验证。验证参数包括：检测限、专属性、耐用性以及对比实验。

翌圣生物针对质控类检测试剂建立了相应的研发和生产平台。其中，研发平台以双向分子酶设计与定向进化平台和蛋白高密度发酵与超洁净纯化平台为依托，建立分子诊断试剂关键原料研发平台和独立的分子和免疫检测产品开发实验室，并配备了先进的研发仪器设备。生产平台，严格按照ISO13485质量体系标准建设和管理，拥有独立的洁净生产车间，满足不同产品定量和定性的要求。层层把关，每一步的放行，都经过多项严格而高标准的质量验收。

基于上述研发和生产平台，翌圣生物可针对生物制品研发和生产过程中的样本，提供配套翌圣生物“支原体qPCR检测试剂盒（探针法）”(货号：40618ES)的方法适用性验证服务。

（最终解释权归翌圣生物所有）

参考文献：