简述bradford法测蛋白浓度实验过程

Bradford法测蛋白浓度是利用蛋白质-染料结合的原理，定量地测定微量蛋白质浓度的快速灵敏的方法。
Bradford法测蛋白浓度原理
考马斯亮蓝(CBB)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，Zda光吸收在488nm;当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质色素结合物在595nm波长下有Zda光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速;其结合物在室温下1h内保持稳定。该法试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1000μg/ml，bradford法测蛋白浓度是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
Bradford法测蛋白浓度试验过程
1、试剂：
（1）考马斯亮蓝试剂：
考马斯亮蓝G250100mg溶于50ml95%乙醇，加入100ml85%H3PO4，用蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。Z终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。
（2）标准蛋白质溶液：
纯的牛血清血蛋白，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。
2.器材：（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器
3、标准曲线的制作
试管编号0123456
100ug/ml标准蛋白（ml）0.00.10.20.30.40.50.6
0.15mol/LNaCl（ml）10.90.80.70.60.5?0.4
考马斯亮蓝试剂（ml）5555555
摇匀，1h内以0号管为空白对照,在595nm处比色
A595nm
以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20ug、30ug、40ug、50ug、60ug），在坐标轴上绘制标准曲线。
4、样品中蛋白质含量的测定
另取两支干净的试管（做一重复），加入合适浓度的待测样品，使其测定值在标准曲线的范围内，测定方法同上，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。
注意事项：
1、如果要求严格，Z好在试剂加入后的5~20min内测定光吸收，因为这段时间内颜色是Z稳定的。
2、若选择在旋涡混合器上混合，注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除。
一、实验目的
用bradford法测蛋白浓度，测定未知蛋白质浓度样品的吸光度，根据标准曲线得到蛋白质的浓度。配制一组浓度分别为0.10mg/ml，0.08mg/ml，0.06mg/ml，0.04mg/ml，0.02mg/ml，0mg/ml的牛血清蛋白（BSA）溶液，测定这组溶液的吸光度，得到蛋白质浓度对吸光度的一条标准曲线。测定未知蛋白质浓度样品的吸光度，根据标准曲线得到蛋白质的浓度。
二、bradford法测蛋白浓度实验过程
1．准备所需的药品和仪器。
2．计算所需配制的溶液的量。
先配制1mg/ml的牛血清蛋白（BSA）母液，再往母液中加入磷酸缓冲溶液（PBS）配制一组浓度分别为1.0mg/ml，0.8mg/ml，0.6mg/ml，0.4mg/ml，0.2mg/ml的BSA溶液，再将这组溶液稀释10倍，得到一组浓度分别为0.10mg/ml，0.08mg/ml，0.06mg/ml，0.04mg/ml，0.02mg/ml的BSA溶液。计算diyi步稀释各组需要的BSA溶液及PBS溶液的体积。
BSA体积（ul）10080604020
PBS体积（ul）900920940960980
BSA浓度（mg/ml）1.00.80.60.40.2
3．具体操作过程。
用天平称量1.00g牛血清蛋白（BSA），溶于去离子水中，配成100ml的溶液，溶液的浓度为10mg/ml。用移液枪分别取100ul，80ul，60ul，40ul，20ul的BSA溶液，置于1.5ml的EP管中，再分别加入900ul，920ul，940ul，960ul，980ul的磷酸缓冲溶液（PBS）配成1ml的溶液，震荡使溶液混合均匀。得到一组浓度分别为1.0mg/ml，0.8mg/ml，0.6mg/ml，0.4mg/ml，0.2mg/ml的BSA溶液。
移液枪分别移取100ul刚配好的一组BSA溶液，置于1.5ml的EP管中，各加入900ul的PBS溶液，震荡使溶液混合均匀。得到一组浓度分别为0.10?mg/ml，0.08mg/ml，0.06mg/ml，0.04mg/ml，0.02mg/ml的BSA溶液。另外量取1ml的PBS溶液（BSA溶液浓度为0?mg/ml）作对照试验。
用移液枪分别移取50ul配好的一组BSA溶液，滴加到孔板中，再分别加入200ul的考马斯亮蓝（CBB）。静置10min后，用酶标仪测得这组BSA溶液的吸光度。
bradford法测蛋白浓度实验结果
通过用Bradford法测蛋白浓度，得到的吸光度对BSA浓度的关系曲线为y=3.09x+0.6807，R2=0.9541。可以看出吸光度浓度的关系曲线中R2值较小，即测得的吸光度与浓度的线性不是很好。究其原因可能有以下两点：一是移液枪的操作不是很熟练，二是移液枪在移液过程中存在着气泡，使移的液体体积不准确。

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