如何用考马斯亮蓝染色法 （Bradford法）测定蛋白质含量

目的和要求

掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理和方法。学习分光光度计的原理及使用法。

原理

1976年Bradford建立了用考马斯亮蓝G250与蛋白质结合的原理，迅速、敏感的定量测定蛋白质的方法。染料与蛋白质结合后引起染料Zda吸收的改变，从465nm变为595nm，光吸收增加。蛋白质染料复合物具有高的消光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度，Zdi检出量为1μg蛋白。染料与蛋白质的结合是很迅速的过程，大约需2min，结合物的颜色在1h内是稳定的。一些阳离子，如K+，Na+，Mg2+，（NH4）2SO4，乙醇等物质不干扰测定，而大量的去污剂如TritonX100，SDS等严重干扰测定，少量的去污剂可通过用适当的对照而消除。由于染色法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。

操作步骤

一、标准方法

取含10～100μg蛋白质溶液于小试管中，用双蒸水或缓冲液调体积到0.1mL，然后加入5mL蛋白试剂，充分振荡混合，2min后于595nm测定光吸收值。以0.1mL双蒸水或缓冲液及5mL蛋白试剂作为空白对照。

二、微量蛋白分析法

取含1～10μg蛋白质溶液，用双蒸水调体积到0.8mL，加0.2mL蛋白试剂，充分振荡混合，2min后于595nm测定光吸收值，以0.8mL双蒸水及0.2mL蛋白试剂作为空白对照。用不同浓度的蛋白质溶液作标准曲线，以蛋白质浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线作为定量的依据。

试剂和器材

一、试剂

1.标准蛋白质溶液：可用牛血清清蛋白预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度配制成1mg/mL的溶液。或根据牛血清清蛋白的紫外消光系数A1%1cm=6.6来确定。

2.蛋白试剂的配制：称取100mg考马斯亮蓝G250溶于50mL95%乙醇，加入100mL85%（W/V）磷酸，将溶液用水稀释到1000mL。试剂的终浓度为0.01%考马斯亮蓝G250，4.7%（W/V）乙醇，和8.5%（W/V）磷酸。

二、器材

1.72型分光光度计

2.微量注射器

3.试管及试管架

4.刻度吸管

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