Colorimetric Malondialdehyde (MDA) assay kit (TBA) 丙二醛(MDA)检测试剂盒（TBA法）

产品简介

 

机体通过酶系统与非酶系统产生氧自由基，后者能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，并因此形成脂质过氧化物。如：醛基（丙二醛MDA）、酮基、羟基、羰基、氢过氧基或内过氧基，以及新的氧自由基等。脂质过氧化作用不仅把活性氧转化成活性化学剂，即非自由基性的脂类分解产物，而且通过链式或链式支链反应，放大活性氧的作用。因此，初始的一个活性氧能导致很多脂类分解产物的形成，这些分解产物中，一些是无害的，另一些则能引起细胞代谢及功能障碍，甚至死亡。氧自由基不但通过生物膜中多不饱和脂肪酸的过氧化引起细胞损伤，而且还能通过脂氢过氧化物的分解产物引起细胞损伤。因而测试MDA的量常常可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤的程度。

MDA的测定常常与SOD的测定相互配合，SOD活力的高低间接反应了机体清除氧自由基的能力，而MDA的高低又间接反应了机体细胞受自由基攻击的严重程度，通过SOD与MDA的结果分析有助于医学、生物学、药理及工农业生产的发展。

本试剂盒是在国内外众多测试方法的基础上改进的一种微量、快速、简便、准确、对操作人员健康无损害的测试方法。通过测试可反映出血清（血浆）、乳汁等细胞外液、红细胞、白细胞、培养细胞以及各种动植物的细胞水平及亚细胞水平的脂质过氧化物的量。

过氧化脂质降解产物中的丙二醛（MDA）可与硫代巴比妥酸（TBA）缩合，形成红色产物，在532 nm处有最大吸收峰。因底物为硫代巴比妥酸（Thibabituric Acid TBA）所以此法称TBA法。

 

产品组分

 

组分编号	组分名称	组分规格	储存条件
60745-A	试剂一	10 mL×1	2~8℃，温度低时会凝固，每次测试前可37℃加热来加速溶解，直至溶液透明方可使用
60745-B	试剂二	6 mL×1	2~8℃，用时每瓶加170 mL蒸馏水混匀（2~8℃保存）
60745-C	试剂三	1 vial	2~8℃，粉末，用时加蒸馏水30 mL（加热到90℃-100℃充分溶解后用蒸馏水补足至30 mL），再加冰醋酸30 mL（2~8℃保存）
60745-D	标准品	5 mL×1	2~8℃，液体（浓度：10 nmol/mL）

 

储存条件

 

2~8℃避光保存，有效期1年。

 

使用说明

 

一. 规范操作方法

1. 操作表：（操作前请仔细阅读下面的“参考取样浓度（量）”）

表1 加样方法

加样种类	空白管	标准管	测定管	对照管
标准品（mL）	/	0.1	/	/
无水乙醇（mL）	0.1	/	/	/
测试样品（mL）	/	/	0.1	0.1
试剂一（mL）	0.1	0.1	0.1	0.1
试剂二（mL）	3.0	3.0	3.0	3.0
试剂三（mL）	1.0	1.0	1.0	/
50%冰醋酸（mL）	/	/	/	1.0

a. 离心管盖上盖，用针在盖上扎一小孔，涡旋混匀器混匀，95℃水浴（或用锅开盖煮沸）40 min，取出后流水冷却，然后3500-4000 rpm，离心10 min，（3000 rpm以下离心时间需延长，目的使沉淀完全。另外如有大量脂质存在，可加入0.1 mL氯仿，涡旋抽提约60 s后再离心）。取上清，倒入1 cm光径比色杯中，蒸馏水调零，波长532 nm处，测各管吸光度OD值（吸取上清比色时不要吸到底部沉淀，用酶标仪读数时只需吸取200-300 μL上清加入到96孔板中，532 nm处读数）。

b. 一般情况下，标准管、空白管每批只需做1-2只，若样本没有特殊颜色、浊度等现象，则对照管可以不测，用空白管来代替对照管。

2. 参考取样浓度（量）：除水生动物类的样本需要提前摸索取样浓度外，其它动物的血清一般直接取样0.1 mL测定（甚至样本量足够时可取0.2 mL或0.3 mL），组织匀浆一般取10%的浓度测定（肝脏样本稍高些，可直接取0.1 mL，其它组织样本量足够时可取0.2 mL或0.3 mL），细胞匀浆或细胞培养液可取样0.3-0.5 mL测定（细胞建议数量＞10⁶）。取样量加大时空白管无水乙醇、标准管标准品量、试剂一量也要相应加大，其它试剂量不变。
3. 标准管参考吸光度：当标准品取样量为0.1 mL时，则分光光度计测定标准管吸光度减去空白管的吸光度为0.065-0.070（酶标仪测定取200 μL读数时为0.04左右）。当标准品取样量为0.2 mL时，则标准管吸光度减去空白管的吸光度为0.130-0.140（酶标仪测定取200 μL读数时为0.08左右）。
4. 规范操作方法及简便操作方法中，若发现检测样本吸光度太低，可以将水浴时间40 min延长至80 min，但相关的MDA的检测都必须延长至80 min，以免造成批间差异。
5. 结果计算

1. 血清（血浆）中MDA含量计算公式：

2. 组织中MDA含量计算公式：

【注】prot指蛋白，nmol/mgprot：纳摩尔/毫克蛋白；

二. 简便操作方法：（如果样本数量很多，可以采用简便操作方法）

1. 混合试剂的配制：

工作液Ⅰ的配制：试剂一：试剂二：试剂三=0.1：3：1，现配现用；

工作液Ⅱ的配制：试剂一：试剂二：50%冰醋酸= 0.1：3：1，现配现用。

2. 简便操作表：

表2 加样方法

加样种类	空白管	标准管	测定管	对照管
标准品（mL）	/	0.1	/	/
无水乙醇（mL）	0.1	/	/	/
测试样品（mL）	/	/	0.1	0.1
工作液Ⅰ（mL）	4.0	4.0	4.0	/
工作液Ⅱ（mL）	/	/	/	4.0

a. 离心管盖上盖，用针在盖上扎一小孔，涡旋混匀器混匀，95℃水浴（或用锅开盖煮沸）40 min，取出后流水冷却，然后3500-4000 rpm，离心10 min。（3000 rpm以下离心时间需延长，目的使沉淀完全。）取上清，倒入1 cm光径比色杯中，蒸馏水调零，波长532 nm处，测各管吸光度OD值（吸取上清比色时不要吸到底部沉淀，用酶标仪读数时只需吸取200-300 μL上清加入到96孔板中，532 nm处读数）。

b. 若样本没有特殊颜色、浊度等现象，则对照管可以不测，用空白管来代替对照管。

3. 样本加入量可根据含量高低来调整，参考上述取样浓度（量）。

4. 以上规范操作法及简便操作法适用于人及各种动植物的样本（包括血清、动植物组织及体液、细胞及细胞培养液等）。

5. 规范操作方法及简便操作方法中，若发现检测样本吸光度太低，可以将水浴时间40 min延长至80 min，但相关的MDA的检测都必须延长至80 min，以免造成批间差异。

6. 结果计算

1. 血清（血浆）中MDA含量计算公式：

2. 组织中MDA含量计算公式：

【注】prot指蛋白，nmol/mgprot：纳摩尔/毫克蛋白；

三. 微量操作方法：（对于MDA含量很低或样本量少的样本可用微量操作方法，例如小鼠（儿）血清（血浆）、小鼠肺组织、皮肤组织、肾组织、视网膜、细胞及细胞培养液等）

1. 样本前处理见实验方法学中的组织匀浆处理，可制成10%或5%的匀浆，但要注意，因样本量很少，所以做好的组织匀浆最好不要离心，例如培养的细胞等破碎后可以不离心。取样时注意要摇匀后立即取样。

2. 试剂组成与配制

微量操作法中的试剂三配制如下：

按规范操作方法来配制MDA 3号试剂：将1支MDA 3号粉末（试剂三）倒入烧杯内加90℃-100℃的热蒸馏水32 mL充分溶解（溶解过程中可适当加热助溶，因蒸馏水热胀冷缩的性质，加热过程会蒸发，本应加30 mL，现多加2 mL，冷却后在30 mL）。随后再加入30 mL冰醋酸混匀即可配成。

再将上述配好MDA 3号试剂用50%冰醋酸按2:1进行稀释（按需配置），混合均匀，现配现用。配好的试剂置于4℃避光保存。

【注】50%冰醋酸的配制：50 mL蒸馏水加50 mL冰醋酸混合而成。

3. 操作步骤：

 

 

 

表3 加样方法

加样种类	空白管	标准管	测定管	对照管
标准品（mL）	/	0.1	/	/
无水乙醇（mL）	0.1	/	/	/
测试样品（mL）	/	/	0.1	0.1
试剂一（mL）	0.1	0.1	0.1	0.1
摇晃离心管架，混匀
试剂二（mL）	1.5	1.5	1.5	1.5
试剂三（mL）	1.5	1.5	1.5	/
50%冰醋酸（mL）	/	/	/	1.5

a. 离心管盖上盖，用针在盖上扎一小孔，涡旋混匀器混匀，95℃水浴（或用锅开盖煮沸）40 min，取出后流水冷却，然后3500-4000 rpm，离心10 min。（3000 rpm以下离心时间需延长，目的使沉淀完全。）取上清，倒入1 cm光径比色杯中，蒸馏水调零，波长532 nm处，测各管吸光度OD值（吸取上清比色时不要吸到底部沉淀，用酶标仪读数时只需吸取200-300 μL上清加入到96孔板中，532 nm处读数）。

【注】（含量较低的样本）在样本量足够时，可增加取样量至0.2 mL（同时无水乙醇、标准品、试剂一量均加0.2 mL，其它试剂量不变）。

b. 一般情况下，标准管、空白管每批只需做1-2只，若样本没有特殊颜色、浊度等现象，则对照管可以不测，用空白管来代替对照管。

4. 用此方法所测各管吸光度值比规范操作方法要高，但不影响最终结果。

5. 若发现检测样本吸光度太低，可以将水浴时间40 min延长至80 min，但相关的MDA的检测都必须延长至80 min，以免造成批间差异。

6. 此方法标准管参考吸光度：当标准品取样量为0.1 mL时，则标准管吸光度减去空白管吸光度为0.103-0.112。当标准品取样量为0.2 mL时，则标准管吸光度减去空白管吸光度为0.206-0.224。

7. 结果计算

1. 血清（血浆）中MDA含量计算公式：

2. 组织中MDA含量计算公式：

【注】prot指蛋白，nmol/mgprot：纳摩尔/毫克蛋白；

四. 高脂血症、油脂样本中的MDA测定操作方法：（例如检测豆油或色拉油、菜油中的MDA含量）

1. 操作方法

表4 加样方法

加样种类	空白管	标准管	测定管
标准品（mL）	/	0.1	/
无水乙醇（mL）	0.1	/	/
油脂类样品或高脂血清（血浆）(mL)	/	/	0.1
试剂一（mL）	0.1	0.1	0.1
摇晃离心管架，混匀
试剂二（mL）	3.0	3.0	3.0
试剂三（mL）	1.0	1.0	1.0
离心管盖上盖，用针在盖上扎一小孔，涡旋混匀器混匀，95℃水浴（或用锅开盖煮沸）80 min，取出后流水冷却
氯仿（mL）	0.1	0.1	0.1
涡旋震荡1-3 min，3500-4000 rpm，离心10 min。取上清，倒入1 cm光径比色杯中，蒸馏水调零，波长532 nm处，测各管吸光度OD值（吸取上清比色时不要吸到底部沉淀和氯仿，用酶标仪读数时只需吸取200-300 μL上清加入到96孔板中，532 nm处读数）

a. 一般情况下，标准管、空白管每批只需做1-2只。

b. 油脂类样本一般要用无水乙醇稀释2-3倍后取样测定。某些高脂血清（血浆）需要用生理盐水稀释2倍后测定。

2. 标准管参考吸光度：当标准品取样量为0.1 mL时，则分光光度计测定标准管吸光度减去空白管的吸光度为0.065-0.070（酶标仪测定取200 μL读数时为0.04左右）。当标准品取样量为0.2 mL时，则标准管吸光度减去空白管的吸光度为0.130-0.140（酶标仪测定取200 μL读数时为0.1左右）。

3. 结果计算

高脂血、油中MDA含量计算公式：

五. 红细胞中的MDA测定操作方法

（一）微量红细胞中的MDA检测方法（样本量少时用）

1. 样本前处理：（可用以下二种方法中的一种）

1. 载玻片取全血，进行MDA测定：

如果您所需测的血样很少又很珍贵，例如新生儿指血，或小老鼠的尾血，可采用载玻片上滴加1-2滴肝素涂匀，60ºC以下烤干，或自然吹干。将以上采取的少量血样滴在有肝素的载玻片上，用微量加样器取您所需的血量，再制备成1︰99的溶血液。（即全血：蒸馏水=1︰99）。

2. 玻璃微量采血管采集红细胞及溶血液的制备：

a. 用20 μL的玻璃微量采血管取载玻片上的肝素抗凝全血20 μL左右。将玻璃毛细采血管置水平位，迅速取下吸球，将空隙长的一端放在酒精灯火焰的三分之一处烧至透红，管端变成圆球状闭结为止。用尺测量并记录血柱长度a厘米。用纸将采血管卷好，然后将采血管封闭端朝下装入离心管中，1500 rpm，离心5-10 min，取出后用小砂轮在血清与红细胞分界处划开掰断（或用剪刀直接剪断）。将有红细胞的开口端倒放入装有1 mL蒸馏水的离心管中，再以1500 rpm，离心5 min，此时毛细管中的红细胞沉淀于离心管底部，用镊子从离心管中取出毛细管丢弃后，将离心管放在混匀器上涡旋混匀制成溶血液。

b. 血液稀释倍数的计算：

2. MDA检测操作步骤

2.1 方法一：（规范操作方法）

表5 加样方法

加样种类	空白管	标准管	测定管	对照管
标准品（mL）	/	0.1	/	/
无水乙醇（mL）	0.1	/	/	/
1:x 血球溶血液（mL）	/	/	0.1	0.1
试剂一（mL）	0.1	0.1	0.1	0.1
摇晃离心管架，混匀
试剂二（mL）	3.0	3.0	3.0	3.0
试剂三（mL）	1.0	1.0	1.0	1.0
50%冰醋酸（mL）	/	/	/	1.0

a. 离心管盖上盖，用针在盖上扎一小孔，涡旋混匀器混匀，95℃水浴（或用锅开盖煮沸）40 min，取出后流水冷却，然后3500-4000 rpm，离心10 min。（3000 rpm以下离心时间需延长，目的使沉淀完全。）取上清，倒入1 cm光径比色杯中，蒸馏水调零，波长532 nm处，测各管吸光度OD值（吸取上清比色时不要吸到底部沉淀，用酶标仪读数时只需吸取200-300 μL上清加入到96孔板中，532 nm处读数）。

b. 一般情况下，标准管、空白管每批只需做1-2只，若样本没有特殊颜色、浊度等现象，则对照管可以不测，用空白管来代替对照管。

c. 若发现检测样本吸光度太低，可以将水浴时间40 min延长至80 min，但相关的MDA的检测都必须延长至80 min，以免造成批间差异。

d. 规范操作方法标准管参考吸光度：当标准品取样量为0.1 mL时，则分光光度计测定标准管吸光度减去空白管的吸光度为0.065-0.070（酶标仪测定取200 μL读数时为0.04左右）。当标准品取样量为0.2 mL时，则标准管吸光度减去空白管的吸光度为0.130-0.140（酶标仪测定取200 μL读数时为0.1左右）。

2.2 方法二：（微量法）

表6 加样方法

加样种类	空白管	标准管	测定管	对照管
标准品（mL）	/	0.1	/	/
无水乙醇（mL）	0.1	/	/	/
测试样品（mL）	/	/	0.1	0.1
试剂一（mL）	0.1	0.1	0.1	0.1
摇晃离心管架，混匀
试剂二（mL）	1.5	1.5	1.5	1.5
试剂三（mL）	1.5	1.5	1.5	/
50%冰醋酸（mL）	/	/	/	1.5

a. 离心管盖上盖，用针在盖上扎一小孔，涡旋混匀器混匀，95℃水浴（或用锅开盖煮沸）40 min，取出后流水冷却，然后3500-4000 rpm，离心10 min。（3000 rpm以下离心时间需延长，目的使沉淀完全。）取上清，倒入1 cm光径比色杯中，蒸馏水调零，波长532 nm处，测各管吸光度OD值（吸取上清比色时不要吸到底部沉淀，用酶标仪读数时只需吸取200-300 μL上清加入到96孔板中，532 nm处读数）。

b. 一般情况下，标准管、空白管每批只需做1-2只，若样本没有特殊颜色、浊度等现象，则对照管可以不测，用空白管来代替对照管。

c. 用此方法所测各管吸光度值比规范操作方法要高，但不影响最终结果。

d. 若发现检测样本吸光度太低，可以将水浴时间40 min延长至80 min，但相关的MDA的检测都必须延长至80 min，以免造成批间差异。

e. 此方法标准管参考吸光度：当标准品取样量为0.1 mL时，则标准管吸光度减去空白管吸光度为0.103-0.112。当标准品取样量为0.2 mL时，则标准管吸光度减去空白管吸光度为0.206-0.224。

【注】将上述配好MDA 3号试剂用50%冰醋酸按2:1进行稀释（按需配置），混合均匀，现配现用。配好的试剂置于4℃避光保存。

【注】50%冰醋酸的配制：50 mL蒸馏水加50 mL冰醋酸混合而成。

3. 红细胞中MDA的计算：

【注】nmol/mgHb：纳摩尔/毫克血红蛋白；

（二）全血中红细胞MDA检测方法（样本量多时用）

1. 样本前处理：

① 血球制备：取肝素抗凝全血0.15 mL，加2-3 mL的生理盐水，2500-3000 rpm，离心5-10 min（小鼠红细胞容易破裂，最好用1000-1500 rpm，离心5-10 min），弃上清留沉淀的红细胞。上清一定要尽量吸净丢弃，以免影响结果。

② 溶血液的制备：取离心后沉淀的红细胞加所取全血体积4倍的蒸馏水（0.6 mL）,在涡旋混匀器上混匀1 min使细胞充分

溶解。

③ 抽提：在上述溶血液中加全血体积2倍的无水乙醇（0.3 mL），也可用95%乙醇代替在涡旋混匀器上充分混匀30 s。

④ 沉淀蛋白：再加全血体积2倍的氯仿（0.3 mL）置涡旋混匀器上混匀1 min，然后3000～3500 rpm，离心5-10 min。此时液体分为三层，上层为MDA抽提液，中层为血红蛋白沉淀物，下层为三氯甲烷。取上清并记录体积，约0.9 mL。

2. 操作步骤：

① 1 nmol/mL标准应用液的配制：将标准品（10 nmol/mL）进行10倍稀释，即标准品1 mL加9 mL的无水乙醇配成 1 nmol/mL 的标准应用液。

② 若发现检测样本吸光度太低，可以将水浴时间40 min延长至80 min，但相关的MDA的检测都必须延长至80 min，以免造成批间差异。

表7 加样方法

加样种类	空白管	标准管	测定管
标准品（1 nmol/mL）（mL）	/	0.8	/
无水乙醇（mL）	0.8	/	/
抽提液（mL）	/	/	0.8
试剂二（mL）	1.0	1.0	1.0
试剂三（mL）	1.0	1.0	1.0

a. 离心管盖上盖，用针在盖上扎一小孔，涡旋混匀器混匀，95℃水浴（或用锅开盖煮沸）40 min，取出后流水冷却，然后3500-4000 rpm，离心10 min。（3000 rpm以下离心时间需延长，目的使沉淀完全。）取上清，倒入1 cm光径比色杯中，蒸馏水调零，波长532 nm处，测各管吸光度OD值（吸取上清比色时不要吸到底部沉淀，用酶标仪读数时只需吸取200-300 μL上清加入到96孔板中，532 nm处读数）。

b. 计算公式：

全血中MDA含量计算公式：

 

注意事项

 

1. 本产品仅作科研用途。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

3. 离心管要洁净，尤其测微量样品时更为重要。

4. 配制试剂时要充分混匀。测试过程中第一管吸的试剂要丢弃，加样品或试剂时要垂直加，不要加在管壁上。95℃水浴前要充分混匀。

5. 温度低时试剂一会凝固，一定要水浴加热至溶液透明方可使用。

6. 水浴时间及温度要固定。没有水浴锅的可用铝锅、铝盒、铝盆等开盖煮沸即可。

7. 离心沉淀一定要充分，否则影响吸光度，造成结果不稳定。这种情况可增加离心转速（＞3000 rpm）或者延长离心时间使沉淀完全。

8. 比色时注意不要将沉淀倒入比色杯中，最好用移液器吸入比色皿。

9. 冬天若发现测试溶液呈雾状可以轻轻放水浴锅稍稍加热，待溶液溶解呈透明状态用移液器吸取放入比色杯中，若仍然呈雾状，则考虑为高脂血症。

10. 样本取样量：若您的样量较多，取样量可以加倍，无水乙醇、标准品、试剂一均要加倍，其它试剂量不变。若您的样本为贫血病人的血样，则取样量也要加倍，无水乙醇、标准品、试剂一的量也要加倍，其它试剂量不变。

11. 洗涤红细胞时，离心后的上清要尽量吸取干净，以保证抽提液体积准确。

12. 95℃水浴时最好用带盖的离心管，以免反应液的蒸发。若没有带盖的离心管可用冰箱保鲜膜盖好，用橡皮筋扎好后在保鲜膜上用针刺一小孔即可代替盖子。

 

Ver.CN20240830