GSTSep Glutathione MagBeads GST标签蛋白纯化磁珠

2.1细菌或酵母表达的蛋白

1）将培养液转移到离心杯中，7,000 rpm (7,500 xg)，离心15 min收集菌体，然后按照菌体：平衡液=1: 10 （W/V）加入平衡液，加入终浓度为1 mM的PMSF。加入溶菌酶，使其工作浓度为0.2-0.4 mg/mL。如果表达的宿主细胞内含pLysS或pLysE，可以不加溶菌酶。

2）同时也可加入其他蛋白酶抑制剂，但不能影响目的蛋白与磁珠的结合。

3）将菌体沉淀悬浮起来，（如果菌液浓度高，也可考虑加入10 μg/mL RNase A和5 μg/mL DNase I）,混匀，冰上超声破碎细胞，至菌液基本保持澄清。

4）将澄清的破碎液转移至离心管中，10,000 rpm (15,000 xg)，4℃离心20-30 min。 取上清，置于冰上备用或-20℃保存。

2.2酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达可溶性蛋白

1）将细胞培养液转移至离心杯中，5,000 rpm (3,800 xg)，离心10 min，收集菌体得上清，即可直接使用。

2）对于大量体积的上清，需加入硫酸铵沉淀浓缩后，然后用Lysis Buffer透析后才能上样。

三、磁珠准备

1.可根据目标蛋白产量和磁珠载量信息来准备适量的磁珠（磁珠体积为总体积的20%）,将磁珠反复颠倒，充分混匀，使用移液器取适量的磁珠悬浮液，置于离心管中，将离心管置于磁分离器上，大约1 min，待溶液变澄清后，用移液器吸弃清液。

2.将离心管从磁分离器上取下来，加入与悬浮液等体积的平衡液，使用枪头反复吹打5次，将离心管置于磁分离器上，大约1 min，待溶液变澄清后，用移液器吸弃清液，重复洗涤2次。

四、GST标签蛋白纯化

1. 结合 将备好的样本加入到处理好的磁珠中，反复颠倒混匀。将离心管置于混合仪上，室温孵育30 min以上（也可根据结合效果调整，延长孵育时间）。

2. 洗杂 将离心管置于磁分离器，大约1 min，待溶液变澄清后，用移液器移出上清液，保留，以备取样检测。向离心管中加入5倍悬浮液体积的洗杂液，使用枪头反复吹打5次，将离心管置于磁分离器上，大约1 min，待溶液变澄清后，用移液器吸弃上清液。至少重复上述步骤2次。

3. 洗脱 在上述离心管中加入3-5倍磁珠体积的洗脱液，用移液器吹打5次，然后在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管，5-10 min后，置于磁分离器上，大约1 min，待溶液变澄清后，吸取上清液，收集洗脱组分，即为目标蛋白。重复操作两次，分别收集洗脱组分，留待检测。

4.磁珠保存 使用后的磁珠用1 mL洗脱液重悬磁珠，然后置于磁分离器上，大约1 min，待溶液变澄清后，吸弃上清液。该操作重复两次。 再加入1 mL平衡液，悬浮磁珠，然后置于磁分离器上，大约1 min,待溶液变澄清后，吸弃上清液。再加入4倍磁珠体积的20%乙醇，置于4℃保存。

五、Pull-Down 实验

1.磁珠结合诱饵蛋白 将含有GST标签诱饵蛋白的样品加入到备好的磁珠中，颠倒混匀。将离心管置于混合仪上，室温孵育30 min以上（时间可根据结合效果调整）。

2.洗杂 将离心管置于磁分离器，大约1min，待溶液变澄清后，用移液器移出上清液，保留，以备取样检测。向离心管中加入5倍悬浮液体积的洗杂液，使用枪头反复吹打5-10次，将离心管置于磁分离器上，大约1 min，待溶液变澄清后，用移液器吸弃上清液。重复上述步骤2次。 即得到GST诱饵蛋白-磁珠复合物。

3.目标蛋白与诱饵蛋白-磁珠复合物结合 将含有目标蛋白的样品加入到处理好的诱饵蛋白-磁珠复合物中，颠倒混匀。将离心管置于混合仪上，室温孵育30 min以上（时间可根据结合效果调整）。

4.洗杂 将离心管置于磁分离器，大约1 min，待溶液变澄清后，用移液器移出上清液，保留，以备取样检测。向离心管中加入5倍悬浮液体积的洗杂液，使用枪头反复吹打5-10次，将离心管置于磁分离器上，大约1 min,待溶液变澄清后，用移液器吸弃上清液。重复上述步骤2次。 目标蛋白通过与诱饵蛋白的结合，从混合体系中被捕获。

5.目的蛋白的洗脱  在上述离心管中加入3-5倍磁珠体积的洗脱液，用移液器吹打5次，然后在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管，5-10 min后， 置于磁分离器上，大约1 min，待溶液变澄清后，吸取上清液，收集洗脱组分，即得到靶蛋白和目标蛋白复合物。再重复操作两次，分别收集洗脱组分，留待检测。

HB220315