TSA Multi-colour Immunofluorescence System Kit (4-Color) 酪酰胺信号放大多重标记试剂盒（四色法）

产品简介

酪酰胺信号放大（TSA）系统可用于检测荧光免疫细胞化学（ICC）、免疫组织化学（IHC）和原位杂交（ISH）技术中的低丰度靶点，可将信号灵敏度提高100倍。荧光标记的酪胺分子在H₂O₂的存在下被二抗标记的辣根过氧化物酶（HRP）催化激活，产生大量的酶促反应，使荧光分子在抗原-抗体结合部位与组织周围的蛋白残基结合，形成大量的荧光分子沉积，实现信号放大，该标记过程迅速（小于10 min），沉积标记可直接在标准或共聚焦显微镜下观察。TSA试剂盒可与传统染色方法结合使用用于多色成像，也可以顺序进行两个或更多个酪酰胺反应以标记一个样品上的不同靶标，譬如本产品是使用了三种不同波长的荧光标记的酪胺分子的试剂盒。

TSA技术可用于酶缀合物和合适的生色底物的明场显微镜检查，也可以与抗荧光素酶结合物组合使用。与普通实验相比，使用TSA试剂可显著提高信号灵敏度，同时保持稳定的特异性和分辨率。此外，TSA试剂盒可以显著减少一抗或探针的消耗量。

Yeasen酪酰胺信号放大（TSA）系列产品包括三款单染试剂盒（60405ES、60406ES、60407ES）和一款多重标记试剂盒（60410ES）：试剂盒60405ES荧光标记信号为fluorescein，在激发和发射波长494 nm/517 nm下显微检测信号；试剂盒60406ES荧光标记信号为Cyanine 3，在激发和发射波长550 nm/570 nm下显微检测信号；试剂盒60407ES荧光标记信号为Cyanine 5，在激发和发射波长648 nm/667 nm下显微检测信号；试剂盒60410ES荧光标记信号为HyperFluor 488，在激发和发射波长495 nm/519 nm下显微检测信号。

本试剂盒是四色荧光标记试剂盒，包含HF 633、HF 546、HF 488和DAPI四种颜色，可以实现样本的多重标记。多重标记是在每次单色荧光标记后，使用热修复法（如微波加热处理）去除非共价结合的抗体后换另一种一抗、荧光素酪胺，如此往复进行。

本试剂盒可使用20 sides。

 

产品信息

货号	60410ES03
规格	1 kit
价格	6585

 

组分信息

组分编号	组分名称	产品编号/规格	储存条件
		60410ES03（20sides）
60410-A	HF 633 Tyramide (200×)	10 μL	-25~-15℃，避光
60410-B	HF 546 Tyramide (200×)	10 μL	-25~-15℃，避光
60410-C	HF 488 Tyramide (200×)	10 μL	-25~-15℃，避光
60410-D	DAPI Solution	2 X 1 mL	-25~-15℃，避光
60410-E	HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, 1 mg/mL	30 μL	-25~-15℃，避光
60410-F	HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody, 1 mg/mL	30 μL	-25~-15℃，避光
60410-G	1× Tyramide Amplification Buffer	6 mL	-25~-15℃，避光
60410-H	BSA	200 mg	-25~-15℃，避光
60410-I	Fluorescence Mounting Medium	400 μL	-25~-15℃，避光

 

储存条件

-25~-15℃避光保存，有效期6个月。

 

使用说明（仅供参考）

一. 自备试剂

(1) 1× PBS（Cat#41403ES）/1×D-PBS（Cat#60152ES）

(2) 4%多聚甲醛固定液（Cat#60536ES）

(3) Triton X-100（Cat#20107ES）

(4) 改进型柠檬酸钠抗原修复液(50X)（Cat#36319ES）

(5) 封闭缓冲液：可将200 mg BSA（60410-H / Cat# 36101ES）溶于20 mL PBS中配置成封闭缓冲液，根据需求量按比例进行配置。

二. 样本处理（适用于细胞和组织染色）

1. 细胞样本

(1) 细胞清洗：1×PBS清洗细胞两次。

(2) 细胞固定：加入适量4%多聚甲醛固定液固定，室温放置20 min。

(3) 细胞清洗：1×PBS清洗细胞两次。

(4) 通透细胞：用配制于PBS中的0.1% Triton X-100溶液通透，室温放置5 min，可根据实际情况调整Triton X-100浓度和通透时间。

(5) 细胞清洗：1×PBS清洗细胞两次。

2. 冷冻组织切片样本

(1) 组织清洗：1×PBS清洗组织两次。

(2) 组织固定：加入适量4%多聚甲醛固定液固定，室温放置20 min。

(3) 组织清洗：1×PBS清洗组织两次。

(4) 通透组织：用配制于PBS中的0.5% Triton X-100溶液通透，室温放置20 min，可根据实际情况调整Triton X-100浓度和通透时间。

(5) 组织清洗：1×PBS清洗组织两次。

3. 石蜡组织切片

(1) 将石蜡切片放置在60℃的烘箱中30 min。

(2) 室温下用二甲苯浸泡石蜡组织切片2次，每次5 min，以彻底脱蜡。

【注】二甲苯有毒，易挥发，请在通风橱中操作。

(3) 室温下，将切片样本浸没于无水乙醇中漂洗2次，每次5 min。

(4) 室温下，将切片样本按照顺序依次浸没在不同浓度梯度的乙醇（95%、90%、80%、70%）中，每种浓度各漂

洗1次，每次5 min。

(5) 室温下，将切片浸没于纯水中漂洗1次，每次3 min，再将切片浸没于1×PBS 中漂洗1次，每次3 min，用滤纸

小心吸干切片样本周围多余液体。

(6) 用铅笔在切片样本周围描绘样品轮廓，以便后续进行通透与标记。

(7) 抗原修复：将改进型柠檬酸钠抗原修复液(50X)用微波炉加热至沸腾，将脱完蜡及复水好的片子置于缓冲液中，间断煮沸10 min。抗原修复后取出于室温中缓慢降温。

【注】此过程中，玻片上组织要一直浸没于缓冲液中，以保证组织的抗原修复效果。不同的样本选择不同的抗原修复方法。

(8) 1×PBS清洗两次。

4. 内源性过氧化物酶灭活（可选）

加入3%过氧化氢覆盖样品并在室温下孵育60 min，淬灭样品的内源性过氧化物酶活性。

5. 免疫标记

(1) 封闭：用封闭缓冲液室温封闭30-60 min。（也可以根据需求，选择羊血清或猴血清等）

(2) 用封闭缓冲液将一抗稀释至适当的浓度。将样品与一抗在室温下孵育2 h或4℃过夜。

(3) 室温下1×PBS洗涤3次，每次5 min

(4) 在封闭缓冲液中将HRP偶连的二抗稀释（一般5 µg/mL的终浓度对于大部分TSA实验均适用，也可以使用浓度梯度来确定最适浓度），随后用该溶液在室温下孵育样品1 h。

(5) 室温下1×PBS洗涤3次，每次5 min。

(6) 计算所需Tyramide工作液量，使用1× Tyramide Amplification Buffer将Tyramide (200 X)按照200: 1的比例稀释Tyramide (200 X)为1X。每个样品通常使用100 µL Tyramide工作液，室温下孵育5-10 min。Tyramide (200 X)的稀释比例可以在1: 50-1: 1000内摸索调节，也可以通过浓度梯度实验确定最合适的稀释比例。 

【注】工作液建议现配现用，保证配置酪酰胺荧光工作液用到的H₂O₂新鲜有效，未使用完请丢弃。Tyramide染色工作液需在4℃下避光保存，最长可保存24 h。每次实验操作结束以后，建议丢弃未用完的酪酰胺荧光工作液。

(7) 在室温下用1×PBS洗涤3次，每次5 min。

(8) 抗体剥离：使用合适的buffer进行微波间断加热处理10-15 min，buffer可以使用改进型柠檬酸钠抗原修复液(50X)（Cat#36319ES），也可以按照您的需要选择别的buffer, 比如Tris-EDTA Buffer (10 mM Tris Base, 1mM EDTA Solution, 0.05% Tween 20, pH 9.0)。

(9) 在室温下用1×PBS洗涤3次，每次5 min。

【注】每一轮染色结束后可通过荧光显微镜确认染色情况。

(10) 从封闭（步骤(1)）开始进行下一个靶标的荧光免疫。

(11) 复染: 使用适量的DAPI染色液浸没样本进行核染色，室温孵育5 min。

(12) 在室温下用1×PBS洗涤3次，每次5 min。

(13) 使用抗荧光淬灭封片剂（Fluorescence Mounting Medium）进行封片。

(14) 显微镜成像。

 

注意事项

1. 不同的荧光试剂盒请按照对应建议波长进行操作。

2. 与荧光二抗相比，TSA试剂盒显示出更高的灵敏度和信号。因此，实验时一抗的使用浓度较低，可以降低非特异性结合带来的背景荧光，我们建议设置一抗浓度梯度以找到最佳浓度。

3. 如需考虑降低自发荧光， 可以使用自发荧光淬灭剂。

4. 较高的浓度一抗或二抗可能会导致信号过强或背景高，可以从1:50到1:1000摸索以找到最佳浓度。

5. 使用前请将产品瞬时离心，以保证产品全在管底，再进行后续实验。

6. 1×Tyramide Amplification Buffer首次使用后，建议小量分装，-15~-25℃保存，避免反复冻融。

7. 为了防止出现假阴性、假阳性的结果，实验过程中需设置阴性对照和阳性对照。对于组织样品，建议对未染色的对照（不添加抗体或酪酰胺）进行成像，确定组织是否有自发荧光，排除对背景的影响。

8. 多色标记时，依据抗原密度不同选择不同荧光素（低密度抗原选择强染料；高密度抗原选择较弱染料）。标记顺序对最终标记效果有一定影响，需自行摸索。

9. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

10. 本产品仅用于科研用途，禁止用于人身上。 

 

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Ver.CN20240509