Hieff NGS® Hyb & Wash Kit 靶向捕获杂交清洗试剂盒

 

Hieff NGS^®Hyb & Wash Kit是专门针对翌圣靶向捕获系列产品开发的捕获杂交清洗试剂，搭配新型双链RNA探针（120-mer）将目标DNA捕捉并富集后进行高通量测序，精心优化的一管式杂交缓冲液体系能得到更稳定且更优异的捕获效果。NGS靶向捕获试剂盒凭借卓越的产品性能，更好的灵敏度及特异性，广泛应用于新型分子诊断与检测等领域的研究。试剂盒中提供的所有试剂都经过了严格的质量控制和功能验证，最大程度上保证了实验的稳定性和重复性。

 

组分信息

组分编号		组分名称	12245ES04	12245ES16	12245ES96
BOX-I	12245-A	Wash Buffer 1	3.2 mL	12.8 mL	76.8 mL
	12245-B	Wash Buffer 2	800 μL	3.2 mL	19.2 mL
	12245-C	Wash Buffer 3	2.8 mL	11.2 mL	67.2 mL
BOX-II	12245-D	2 × Hyb Buffer	72 μL	290 μL	1.73 mL
	12245-E	RNase Inhibitor	2 μL	10 μL	50 µL
	12245-F	Post PCR Mix	100 μL	400 μL	2.4 mL

 

储存条件

BOX-I：室温保存，有效期1年。

BOX-II：-25~-15℃保存，有效期1年。

 

注意事项

1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
2. 对于FFPE样本，由于样本降解程度不同，建议不与其他样本类型一起进行捕获。
3. 预文库质控：将已准备好的DNA预文库使用Qubit准确测定浓度，并使用1%的琼脂糖电泳或自动化毛细管电泳进行质控评估。文库主峰大约在300-400 bp，预文库总量一般为1-2 µg左右 。
4. 需保证所使用PCR管，96孔板或8连管和盖子或膜的密封性以及和PCR仪器的适配性，在第一次实验前必须做密封性检测实验。建议在待测管中加入36 µL Nuclease-free Water，盖严压紧后在热盖模式下65℃过夜，用移液器去除剩余液体，确保体积不低于30 µL，管子和盖子不变形。
5. 使用前请核对预文库的接头类型，选择对应的Blockers；如使用的Blockers与预文库接头类型不匹配，将造成捕获文库的中靶率降低、杂交捕获反应失败。
6. 杂交和清洗过程中需严格控制温度，如温度控制不准确，可能导致捕获文库的中靶率及均一度降低。
7. 磁珠浓缩预文库可能导致GC偏好，推荐使用真空浓缩仪对预文库进行浓缩。
8. 在漂洗链霉亲和磁珠后，使用Nuclease-free ddH₂O重悬磁珠，切勿丢弃磁珠。
9. 本产品仅作科研用途！

 

使用说明

一、自备材料

1. 配套试剂

货号	名称	备注
13577ES	Hieff NGS® DNA Library Prep Kit	机械法预文库制备
12195ES	Hieff NGS® OnePot Pro DNA Library Prep Kit V2	酶切法预文库制备
12244ES	Hieff NGS® Human All Exon Probes	人全外显子探针
12246ES	Hieff NGS® Universal Blocking Oligo (with cot-1)	接头封阻剂
12247ES	Hieff NGS® Universal Post PCR Primer for Illumina	扩增引物
12248ES	Hieff NGS® Hyper Enrichment Beads	捕获磁珠
12601ES	Hieff NGS® DNA Selection Beads	纯化磁珠
12642ES	1×dsDNA HS Assay Kit	测定捕获后终文库浓度

2. 其他材料

无水乙醇、Nuclease-free Water、Low TE (pH 8.0)；

200 μl低吸附PCR管、8连管、96孔板、1.5 ml低吸附Nuclease-free离心管、磁力架；

3. 配套仪器

真空浓缩器、PCR仪、金属浴、垂直旋转仪、涡旋振荡仪、微型离心机、Qubit定量仪、移液器、Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer或其他等效产品。

二、操作流程

图1杂交捕获实验流程图

三、操作步骤

1. 样本及探针杂交

1.1 从-20 ℃冰箱取出Hieff NGS^® Hyb & Wash Kit Box-II 和 Hieff NGS® Universal Blocking Oligo (with cot-1)，并取出-80 ℃冰箱保存的Probes。 2 × Hyb Buffer放置于65 ℃金属浴中预热。Probes、RNase Inhibitor和Universal Blocking Oligo (with cot-1)放置于冰上融化。其余组分放回冰箱保存。

1.2 根据Qubit浓度，将1-6个预文库等量混合到一个新的PCR管, 8连管或96孔板中（建议使用96孔板或8连管做，如果使用单管则需要在杂交过程中的PCR仪上该单管四周放置4个空PCR管进行支撑，避免变形）。具体用量参考表1，确保每个预文库所用的 Index 是唯一的。对于cfDNA、FFPE样本或其他质量较差的样本建议采用1个预文库单独进行杂交捕获，并取全部的文库进入杂交过程。

【注】Qubit 浓度为较精确的检测，浓度定量的误差可能导致测序时数据产量的不均一。

表1  预文库Pooling

每个Pool包含的预文库数	每个Index文库的量	Pool的总量
1	750 ng	750 ng
2	500 ng	1000 ng
3	500 ng	1500 ng
4	500 ng	2000 ng
5	500 ng	2500 ng
6	500 ng	3000 ng

1.3 若根据上表计算的预文库投入量体积不超过5 µL，直接补水至5 µL。若预文库投入体积超过5 µL，则需使用浓缩干燥仪进行浓缩，浓缩温度不超过45℃。将离心管放入离心浓缩仪。打开PCR管盖，启动离心浓缩仪，开始浓缩。根据离心浓缩仪的型号不同，干燥时间5-15 min不等，注意观察。干燥后加入5 µL Nuclease-free Water充分震荡混匀，离心后静置备用。

【注】不能过分干燥，否则会造成DNA溶解困难。若无浓缩干燥仪设备，可以采用附件1的磁珠浓缩富集的替代方案。但会引起文库的少量损失。1.4 取新的1.5 mL离心管或0.2 mL PCR管放置于常温管架上进行杂交混合液的配制。对于全外显子的Panel探针杂交体系配制参考表2。从65 ℃金属浴上取下2 × Hyb Buffer，观察底部确保其澄清透明无沉淀。按照表格中的体积和样本量计算，依次加入其他试剂，然后上下颠倒2次后使用旋涡混匀仪震荡2 s混匀，快速离心5 s将管壁液体离心至管底，配制成单个或多个杂交混合液，放置于常温备用。

【注】2 × Hyb Buffer 比较粘稠，需要缓慢吸取。不要在冰上配制杂交混合液。对于多个杂交建议按照每个组分体积乘以实际杂交反应数再乘以1.2倍配制混合液。

表2  全外显子的Panel探针杂交体系配制

名称	1次反应体积（µL）	8次反应体积（µL）	16次反应体积（µL）
Universal Blocking Oligo (with cot-1)	7.5	72	144
2 × Hyb Buffer	18	172.8	345.6
RNase Inhibitor	0.5	4.8	9.6
Human All Exon Probes	5	48	96
Total	31	297.6	595.2

1.5 将配制好的杂交混合液按照每个反应31 µL加入到步骤1.3的5 µL预文库中，并使用移液器轻轻吹打混匀8次 (注意吹打过程时移液器下压到取液量程2/3左右然后松开，反复8次，避免全部按压到底产生气泡)。用管盖或96孔板密封膜密封，快速离心5 s。将预文库杂交混合液放置于杂交用的PCR仪上。

【注】确保彻底密封，建议使用压盖器或压膜刮板。

1.6 设定表3所示反应程序，热盖模式（105℃），设定体积40 µL（杂交总体积36 µL）。

表3  杂交 PCR 程序

温度	时间
热盖105 °C	On
95 °C	30 s
65 °C	Hold

1.7 运行表3的PCR程序，65 °C杂交16 h。

【注】杂交15 - 20 h不影响下游捕获性能，一般可以考虑第一天下午4 - 5时做上杂交，第二天上午8 - 9时进行杂交后捕获。

2. 链霉亲和素磁珠准备

2.1 捕获前，先从4 ℃冰箱取出Hieff NGS^® Hyper Enrichment Beads，在漩涡震荡器上震荡30 s至磁珠充分重悬后，室温平衡30 min以上。

2.2 在室温平衡 30 min期间，从常温的Hieff NGS^® Hyb & Wash Kit Box-I中取出 Wash Buffer 1，Wash Buffer 2和 Wash Buffer 3，在另外一台PCR仪上，设置65 ℃ Hold，热盖程序点击开启（热盖设定为70 ℃）。放入多个8连管或96孔板到PCR仪上，根据杂交反应数，每个反应准备3管Wash Buffer 3。按照每个孔170 μL Wash Buffer 3 加入8连管或96孔板，盖好管盖并确保密封，备用。

【注】如果没有足够的PCR仪，可以采用金属浴或水浴锅代替，但务必用标准温度计测量以确保温度非常准确，如果温度低于65℃会导致捕获效率下降。

2.3 室温平衡30 min后，再将Hieff NGS^® Hyper Enrichment Beads在漩涡震荡器上震荡30 s重悬，向8连管的每个孔中加入50 µL Hieff NGS^® Hyper Enrichment Beads，注意加到管底位置，避免沾到管壁和管盖部分。

2.4 然后向每个孔加入150 μL的Wash Buffer 1，用8连排移液器轻轻吹打8次，充分混匀磁珠。

2.5 放置于磁力架上静置澄清后弃掉上清液。如果管壁或管盖有沾到磁珠，则快速离心5 s甩至管底。

【注】确保全部磁珠在管底侧壁，吸取过程移液器枪头从磁力架对侧贴近管壁逐渐向下吸取，直至管底。避免吸上清过程吸入磁珠。

2.6 重复操作步骤2.4 - 2.5，Wash Buffer 1总共清洗3次，最后吸走上清液，仅保留磁珠在管底。

2.7 最后每个孔加入150 µL的Wash Buffer 1重悬磁珠，在每个孔上标记对应的杂交样本名称，室温放置待用。

3. 捕获磁珠富集文库及清洗

3.1 杂交混合液65 ℃孵育16 h后，确保剩余杂交体系体积不低于20 µL，在PCR仪上打开PCR管、8连管或96孔板，用8连排移液器将准备好的150 μL磁珠重悬液加入到杂交混合液中，并使用移液器轻轻吹打8次。然后将包含磁珠和杂交体系的混合液全部转移至2.7步骤中标记的磁珠8连管中，注意杂交管上的标记和磁珠管上的标记一一对应。

【注】不要从PCR仪上拿下杂交混合液。温度的下降会导致捕获效率降低。

3.2 将上述磁珠杂交混合液从PCR仪上取下放置在垂直旋转仪上并固定好，室温旋转孵育30 min。也可以用震荡金属浴，设置为1000-1500 r/min进行室温震荡孵育。

【注】取下杂交混合液后PCR仪不要关闭，保持65 ℃，后续步骤的Wash buffer3孵育清洗时需用。

3.3 从-20 ℃冰箱取出Hieff NGS^® Hyb & Wash Kit Box-II和Universal Post PCR Primer for Illumina, 找到Post PCR Primer for Illumina和Post PCR Mix放置于冰上融化。

3.4 30 min后从旋转仪或震荡金属浴上取下8连管，快速离心5 s，放置磁力架2-5 min，确保液体清澈，吸弃上清。

3.5 从磁力架上取下8连管，每个孔加入150 μL的Wash Buffer 2来重悬磁珠，移液器轻轻吹打10次，室温孵育15 min，每间隔5 min，上下快速颠倒15次。

3.6 Wash Buffer 2室温孵育完成后，快速离心5 s后放置在磁力架上待液体清澈后，吸弃上清液，放置在65 ℃杂交用的PCR仪上，立即用8连排移液器加入150 μL的已预热好的Wash Buffer 3，在PCR仪上吹吸10次使磁珠充分混匀，盖上管盖65 ℃孵育10 min。

【注】吸取上清后需要快速加入 Wash Buffer 3，磁珠不能干燥。

3.7 65 ℃孵育10 min后，从PCR仪中取出反应管并放置在磁力架上，待液体清澈后吸弃上清。

3.8 重复步骤3.6-3.7，Wash Buffer 3共清洗3次。

【注】磁力架尽可能靠近PCR仪，从PCR仪上取下8连管放在磁力架上，时间尽可能短，避免温度的大幅下降。

3.9 在Wash Buffer 3孵育期间，在冰上采用1.5 mL LoBind管配置Post-PCR反应体系，参考表4。按照反应数目分装到新的8连管或96孔板，每孔30 µL。做好样本标记，放置于冰上备用。同时取出Hieff NGS^® DNA Selection Beads纯化磁珠放置室温平衡至少30 min。

表4  Post -PCR 反应体系

名称	1次反应体积（µL）	8次反应体积（µL）	16次反应体积（µL）
Post PCR Mix	25	240	480
Post PCR Primer for Illumina	5	48	96
Total	30	288	546

【注】对于多个PCR体系建议按照每个组分体积乘以实际反应数再乘以 1.2 倍配制混合液

3.10 三次清洗完成后，快速离心10 s，再次放置于磁力架上用10 µL移液器尽可能吸走全部残余液体，最后加入20 µL Nuclease-free Water重悬磁珠，移液器轻轻吹打8次，将8连排移液器量程调至40 µL，吸取全部磁珠混悬液加入3.9步骤标记好的8连管或96孔板中，再次轻轻吹打混匀8次，确保磁珠和PCR反应体系混合均匀。

【注】包含磁珠的PCR反应液不要离心，尽快放置于PCR仪上开始运行程序。

4. Post-PCR反应

4.1 将步骤3.10的混合体系放置于PCR仪上，按照表5程序进行PCR扩增：

表5  Post - PCR反应程序

温度	时间	循环数
98°C	45 s	1
98°C	15 s	循环数参照表6
60°C	30 sec
72°C	30 sec
72°C	5 min	1
4°C	Hold	-

4.2 根据所使用的Probes类型选择不同的PCR循环数，表6为建议起始循环数：

表6  Post - PCR循环数推荐

Probes	单杂	2-4个样品多杂	5-6个样品多杂
＜0.5 Mb	13-14	12-13	11-12
0.5 Mb-3 Mb	12-13	11-12	10-11
3 Mb-5 Mb	11-12	10-11	9-10
＞5 Mb	10-11	9-10	8-9

4.3 PCR 完成后，将8连管或96孔板取下，快速离心5 s后放置于磁力架上，静置1 min后吸取全部上清液转移至新的PCR管中，然后加入90 µL（1.8×）Hieff NGS^® DNA Selection Beads纯化磁珠，移液器吹打8-10次充分混匀。

【注】上清液中包括捕获后文库，请勿遗弃。确保Hieff NGS^® DNA Selection Beads纯化磁珠已在室温平衡30 min以上，且使用前需充分斡旋混匀。

4.4 室温放置5 min。在此期间准备80%的乙醇，用Nuclease-free Water进行配制，每个样本预计用量400 µL。

【注】此时PCR管不要放在磁力架上。

4.5 放置于磁力架上静置3- 5 min澄清后吸弃上清液。

4.6 管子保持在磁力架上不要取下，加入150 µL 80%的乙醇，静置至磁珠完全吸附到一侧后，将管子从磁力架上取下方向调转180度，待磁珠完全吸附到另一侧后，再次调转。共调转4次后，吸弃上清。

4.7 重复步骤4.6操作。

4.8 快速离心后用10 µL移液器弃去残余乙醇，室温放置1- 3 min，直至磁珠表面无明显液体残留，呈无光泽或哑光状态。

【注】磁珠不要干燥过度以防文库产量降低。

4.9 从磁力架上取下管子，加入20 µL的Low TE洗脱，移液器吹打8- 10次后室温静置2 min。

4.10 放置于磁力架上静置澄清后吸取上清液，转移至新的PCR管中，放置于-20 ℃冰箱保存，待文库质检和上机。

5. 文库质检和上机准备

5.1 使用Agilent Bioanalyzer 2100仪器对样本进行质检，2100所需试剂为High Sensitivity DNA Assay。

5.2 杂交捕获文库的峰值约为300~ 500bp, 一般文库浓度约在0.5-10 ng/µL。文库适用于Illumina (HiSeq 3000/ 4000，NextSeq platform，X-Ten及NovaSeq等平台）。对于存在降解的FFPE样本，建议额外提高测试数据量。

【注】如果文库有小片段残余，总量足够情况下，可补水至50 µL，0.8X（40 µL）磁珠再纯化一次。