TRITC Phalloidin 罗丹明标记鬼笔环肽

需要自备材料

1） （可选）甲醇

2） 1×PBS 缓冲液, pH 7.4, 细胞培养级别（货号：41403ES76）

3） 固定液 4%多聚甲醛（溶于 PBS 缓冲液）（货号：60536ES60）

4） 丙酮或透化液 0.5% Triton X-100（溶于 PBS 缓冲液）

5） Fluoromount-GTM   水溶性封片剂（不含 DAPI）（货号：36307ES08），DAPI（货号：40727ES10）

6） （可选）DAPI Fluoromount-GTM  水溶性封片剂（含 DAPI）（货号：36308ES11）

7） （可选）BSA，标准级别（货号：36101ES25）

8） 载玻片和盖玻片

9） 盖玻片周围密封液（如透明指甲油）

10）组装有 TRITC 激发/发射滤片，以及 DAPI 激发/发射滤片的荧光显微镜或共聚焦显微镜。

操作步骤

1.工作液准备

1）对于 TRITC 标记鬼笔环肽（货号：40734ES75，300 T）

本品以溶于甲醇的 20 µM 储存液形式提供，总量为 300 µL。按照 100 nM 的工作液浓度来换算，可制备总量为 60 mL 的工 作液。建议收到产品后，根据单次使用量，对母液进行小量分装，-20℃避光冻存，一年稳定。

开始实验前，使用 1×PBS 缓冲液稀释储存液到需要的工作浓度。推荐工作浓度为：80~200 nM。工作液现配现用。

2）对于 TRITC 标记鬼笔环肽（货号：40734ES80，1 mg）

本品以冻干粉形式提供，分子量为 1231.4，总量为 1 mg。可先用甲醇或者 DMSO 充分溶解配制成 20~100 µM 的储存液。 如，加入 8.1208 mL 甲醇到 1 mg 鬼笔环肽即得到 100 µM 等量的储存液，根据单次使用量，进行小量分装，-20℃避光冻 存，一年稳定。

开始实验前，使用 1×PBS 缓冲液稀释储存液到需要的工作浓度。推荐工作浓度为：80~200  nM。工作液现配现用。

2.染色步骤

1）细胞爬片生长 24 h，使其密度达到 50%汇合度。

2）吸掉培养液，37℃预热的 1×PBS（pH 7.4）清洗细胞 2 次。

3）使用溶于 PBS 的 4%甲醛溶液进行细胞固定，室温固定 10 min。

【注】避免固定剂中含有甲醇成分，因为甲醇在固定过程中可能破坏肌动蛋白。

4）室温条件下，用 PBS 清洗细胞 2~3 次，每次 10 min。

5）室温条件下，用丙酮（≤-20℃）脱水或者用 0.5% Triton X-100 溶液透化处理 5 min。

6）室温条件下，用 PBS 清洗细胞 2~3 次，每次 10 min。

7）取 200 µL 配制好的 TRITC 标记鬼笔环肽工作液，覆盖住盖玻片上的细胞，室温避光孵育 30 min（通常情况下，4℃~37℃ 孵育皆可）。

【注】为了降低背景，可于 TRITC 标记的鬼笔环肽工作液内加入 1% BSA；另外，孵育过程中为了避免溶液挥发，可 将盖玻片转移到一个密封的容器内。

8）用 PBS 清洗盖玻片 3 次，每次 5 min。

9）使用 200 µL DAPI 溶液（浓度：100 nM）对细胞核进行复染，约 30 s。

10）用 PBS 清洗盖玻片，然后倒置在已经滴有一滴 Fluoromount-GTM 水溶性封片剂的载玻片上。使用纸巾轻轻檫掉多余封 片剂，然后用指甲油永久封片。此法制备的标本玻片可置于 4℃避光保存，通常 6 个月内可继续做 F-actin 染色分析。

【注】也可以直接使用含有 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂（货号：36308ES11）合并步骤 9）10），简化步骤。

11）荧光显微镜或者共聚焦显微镜下进行荧光观察，选择 TRITC 激发/发射滤片（Ex/Em=545/570 nm）和 DAPI 激发/发射滤 片（Ex/Em=364/454 nm）。

HB221130