ibidi提供了一个简单经济GX的方案,使用可移除的12孔腔室载玻片进行细胞的培养,固定和染色。培养MCF-7细胞并用formalin溶液固定。细胞核用DAPI和肌动蛋白骨架用DYE-490鬼笔环肽染色。可以使用一抗和二抗染色通过免疫细胞化学探测其他细胞内结构。
德国ibidi 81201载玻片
实验使用的材料和试剂列于下面。
12孔腔室载玻片,可移除(ibidi,81201)
用于腔室的盖玻片,可移除,24mm x 60 mm(ibidi,10811)
细胞:MCF-7(CLS,300273)
细胞培养基
细胞培养试剂
聚苯硫醚
formalin溶液中性缓冲液,10%(Sigma,HT5011)
染色试剂
o DAPI(Sigma,D954)
o DYE-490鬼笔环肽(Dynomics,490-33)
安装介质:FluoroshieldTm值(Sigma,F6182)
实验方案:
步骤1:
必须在预实验中确定细胞系的正确接种浓度。根据您的细胞类型,用2-6x10 4细胞/ ml在2-3天内产生汇合的单层。
1.打开12孔可移除腔室载玻片(ibidi,81201)包装,在无菌条件下可拆除。
2.像往常一样用胰蛋白酶消化并计数细胞。细胞浓度为5×104细胞/ ml MCF-7。
3. 将250μl细胞悬浮液加入腔室的每个孔中。避免摇晃,因为这会导致细胞分布不均匀。
4. 用配套的盖子盖住。在37°C和5%CO2下培养。细胞至少培养24小时,或直到建立融合的单层
步骤2:
固定是染色程序的DY步。目标是将细胞,细胞形成物或组织维持在其当前状态,并在较长时间内通过化学试剂保存。
1.小心地吸出细胞培养基。
2.用PBS洗两次。
3.加入250μl的formalin溶液。
4.在室温下孵育30分钟。
5.小心吸入formalin溶液。
6.用PBS洗涤三次。
步骤3:
应根据感兴趣的细胞结构选择染色试剂。在该方案中使用DAPI和DYE-490鬼笔环肽染色MCF-7细胞的细胞核和肌动蛋白骨架。
1.准备你的染色溶液:· 聚苯硫醚· DYE-490鬼笔环肽· DAPI 1µg/ml
2.小心吸出PBS。
3.移取250μl染色溶液到每个孔中
4.在室温下避光孵育30分钟
步骤4:
在染色后清洗你的样本会使背景信号降到很低
1.小心地吸出染色溶液
2.加入250μl缓冲液
3.小心吸入缓冲液
4.重复步骤2和步骤3一次
步骤5:
从一个边部开始,用手或用镊子小心地取下硅胶垫圈。该步骤应以缓慢,稳定的进行,以避免损坏细胞层。
步骤6:
完成染色程序后,必须在用显微镜成像之前封固样品。该步骤还防止样品脱水。
1.将载玻片侧面在干净的实验室湿巾上轻敲,从样品中去除多余的介质。
2.将封固剂涂在样品上。用24毫米x 60毫米的盖玻片覆盖安装的样品,小心地将盖玻片放到安装介质上,以避免夹住任何气泡。推荐使用诸如FluoroshieldTm值(Sigma-Aldrich),Vectashield®(Vector Laboratories Inc.)或ProLongAntifade®(ThermoFisher Scientific)的硬化封固剂。
3.安装封固剂固化。
步骤7:显微观察
使用12孔可移除载玻片培养MCF-7细胞,用DAPI和DYE 490鬼笔环肽染色细胞结构。使用硬化封固剂安装载玻片保存样品以便长期储存。
图1用DYE490鬼笔环肽(左上)染色MCF-7细胞的肌动蛋白骨架,并用DAPI(右上)染色细胞核。下图显示了合成图像,其中细胞核为蓝色,肌动蛋白骨骼为绿色。(比例尺:100μm)
使用免疫荧光显微镜观察细胞结构需要a特异的抗体b扫描电镜c带有一定波长过虑镜片的光镜d荧光试剂e透射电镜.
如题,细胞转染质粒24小时后能做免疫荧光实验吗?我们实验室一直是48小时候做,但是由于时间又冲突,我想提前
免疫荧光中如果要封闭抗原 是用BSA吗 多少浓度 在孵育一抗前 还是之后 可以使用无蛋白封闭液 PW04
高品质的荧光显微镜是临床实验室完成间接免疫荧光检测的必备实验条件。目前,
样本IF方案存在于多种不同的样本当中。最简单最常用的方法是对细胞培养物中的培养(真核)细胞进行染色。贴壁生长
最近高分辨率成像技术的发展使研究人员能够通过使用免疫荧光染色在其感兴趣的细胞和组织中可视化亚微米级甚至纳米级
免疫荧光技术(Immunofluorescence technique)又称荧光抗体技术,是标记免疫技术中发展
货号:80381 1.没有 15 mm 玻璃盖玻片可以使用3 孔可移除的腔室载玻片吗? 可以的。在此腔室载玻片中可以在没
1. 基本信息 下面的应用描述了小鼠巨噬细胞系RAW-264.7(生物安全等级2)在ibidi µ-Slides V
01、故障排除 免疫荧光染色是一种非常敏感的方法,需要大量的经验和不断优化。方案中微小的变化可以显着改变结果。