naica® PCR MIX与naica®数字PCR检测更配

法国Stilla Technologies公司开发的—款多重PCR专用预混液：naica^®multiplex PCR MIX（见表1），专用于naica^®六通道微滴芯片数字PCR系统的多重检测。并对naica^®multiplex PCR MIX的多重检测性能进行了详细评估。当面对有限的样本量时，可保证多重数字PCR检测的灵敏度和准确性；在复杂背景基因存在的情况下，依然能精确检出低丰度的目的基因。

★ naica^®multiplex PCR MIX在naica^®六通道微滴芯片数字PCR上进行6个靶标的同步准确定量

采用0.2~13000cp/ul的DNA样品，使用10X naica^®multiplex PCR MIX在naica^®六通道微滴芯片数字PCR系统上进行6个靶标的线性范围分析，结果显示6个靶标的R²均＞0.99，说明在naica^®六通道微滴芯片数字PCR系统上，能够可靠地实现6靶标同步准确定量（图1)。与2X和5X浓度的数字PCR预混液(dPCR Mixes)相比，10X浓度的数字PCR预混液体积加入量降低了50％至80％，最大限度地提高样品加入量。尤其是在检测低浓度样品或稀有靶标时，样品加入量的增加可提高检测灵敏度。

▲ 图1：使用naica^®multiplex PCR MIX在naica^®六通道微滴芯片数字PCR上进行6个靶标的线性分析，分别在蓝色、青色、绿色、黄色、红色和红外线6个通道进行检测。每个稀释点的DNA浓度分别为：0.2、1.5、8.0、50、320、2050和13000 cp/ul，每个稀释度进行3次重复。结果显示6个靶标的R2均大于0.99，说明所有靶标的结果都高度真实可靠。

★ 在复杂的背景基因下，对低丰度目的基因进行精确定量

数字PCR的—个重要技术优势是能够在存在多个靶标扩增的情况下检测到低浓度靶标。为了评估naica^®multiplex PCR MIX的稳定性。使用同一个目标DNA模板的不同浓度系列稀释液（0.2~ 13000 cp/uL)进行检测，同时其中掺入5种外部靶标模板（每个靶标的浓度为3000 cp/ul)。在不同测试条件下，结果均呈现良好的线性关系（图2A和2C)。这些结果与同一DNA 靶点在不同浓度下单独检测以及在不添加外部靶标的情况下获得的结果具有可比性（图2B和2D）。

▲ 图2：使用naica^®multiplex PCR MIX的扩增结果真实可靠。将pUC18质粒（图A和B)和pUC57质粒（图C和D)的13000至0.2 cp/ul的系列稀释液在5个外部扩增靶标背景下（每个靶标为3000 cp/ul(A,C)）和在不含外部靶标(B,D)的情况下进行定量检测，3次重复。线性拟合系数 R2>0.99，表明在不考虑多重背景的情况下，对所有靶标的测定结果都是真实可靠的。5个外部靶标的相对标准偏差保持在2.3％至3.1% (n=21)，显示出极好的重复性。

★ naica^®multiplex PCR MIX应用亮点

☑  实现数字PCR方法多重检测的高度稳定性和高检测灵敏度；

☑  可在naica^®六通道微滴芯片数字PCR系统的动态范围内同时定量检测6个独立的DNA靶标，均具有良好线性关系；

☑  5X和10X的数字PCR预混液，提高了naica^®六通道微滴芯片数字PCR系统高阶多重检测能力；

☑  10X PCR MIX比5X PCR MIX降低50％的体积用量，从而增加DNA的加入量。在检测低浓度样品或稀有靶标时，样本加入量的增加可提高检测灵敏度。

表1 naica^®multiplex PCR MIX货号及规格

naica^®六通道微滴芯片数字PCR系统

法国Stilla Technologies公司naica^®六通道微滴芯片数字PCR系统，源于Crystal微滴芯片式数字PCR技术，自动化微滴生成和扩增，每个样本孔可实现6荧光通道的检测，智能化识别微滴并进行质控，3小时内即可获得至少6个靶标基因的拷贝数浓度。

全封闭Naica数字PCR新型冠状病毒超敏检测方案

Cycloud与MicroFuture合作

深蓝云生物科技与北京微未来科技，基于国家疾控ZX和WHO推荐区域，针对2019新型冠状病毒的四段保守序列作为检测靶标，开发超敏的数字PCR检测方法和快速的定量PCR检测方法。

【图源：北京微未来科技】

区段分别为：RdRP基因（特异性靶点），E蛋白基因，N蛋白基因，保守基因S区位点。确保对2019新型冠状病毒鉴定的高度特异性和灵敏度。      

与人冠状病毒HcoV-229E、 HcoV-HKU1、 HcoV-OC43、 HcoV-NL63等型无交叉。

深蓝云生物科技以专业服务科学为使命，愿所学，以致用，共战病毒！

北京微未来科技有限公司以“解码病原微生物，致力于传染病防控”为企业使命。与北京深蓝云生物科技共同在病毒的超敏检测的数字PCR方法展开深入合作。 

联系方式：

公司名称：北京深蓝云生物科技有限公司
联系电话：010-57256059
E-mail：info@cycloudbio.com

在2021版的Methods in Molecular Biology·Lung Cancer第10章(127页开始)介绍了使用naica^®六通道微滴芯片数字PCR系统检测NSCLC患者ctDNA样本中的19种活化和耐药位点，并对检测方法进行了详细的描述。

naica^®六通道微滴芯片数字PCR系统检测流程

文中阐述，naica^®六通道微滴芯片数字PCR系统多重检测速度快，每个患者样本可获得大量突变信息，通过naica^®六通道微滴芯片数字PCR系统进行液体活检可实现高灵敏度和高效的治疗监测，早期发现治疗耐药性。

Methods in Molecular Biology是Springer出版的权威分子生物学方法学系列著作，共1110册，涵盖了生物学的方方面面。包括生命科学、药物科学、化学、药学、材料学、细胞生物学、生物化学、人类基因组学、植物性、免疫学等。Lung Cancer就肺肿瘤生物学常用的实验方法进行了深入的讨论和细致的描述，包括用于建立肺癌诊断和预后的相关研究方法。

naica^®六通道微滴芯片数字PCR系统

法国Stilla Technologies公司naica^®六通道微滴芯片数字PCR系统，源于Crystal微滴芯片式数字PCR技术，自动化微滴生成和扩增，每个样本孔可实现6荧光通道的检测，智能化识别微滴并进行质控，3小时内即可获得至少6个靶标基因的拷贝数浓度。

背景导读—何为嵌合状态的检测？

gusui和外周血干细胞移植是许多恶性和非恶性疾病的有效ZL方法。造血干细胞移植后，受体产生新的血细胞，这些血细胞在遗传上来自于供体DNA。确认新的造血系统来源于供体是临床复发监测的重要组成部分。一般采用血细胞基因型检测的方式，称为嵌合体分析。完全供体细胞嵌合状态意味着100%的血细胞来自供体，而混合或部分嵌合意味着受体细胞也存在。因此检测时需要分析受体在移植后的血液或gusui中供体和受体的基因型的各自比例。

法国苏黎世输血服务ZX实验室使用Stilla Technologies的Naica™ Crystal数字PCR系统进行双等位基因单核苷酸变异（SNV）检测，从而确定嵌合体状态。

嵌合体检测的两步策略

移植前：要想得到正确的移植后的检测结果,必须选择合适的标记物，苏黎世输血服务ZX实验室建立了一个由24种特定SNV分析组成的组合，用于寻找在单个样品分析中筛选供体和受体DNA的合适标记。

移植后：在临床上，嵌合体监测至少需要0.5%的等位基因敏感性。Naica™ Crystal 数字PCR仅使用5ng DNA，就达到了所需的0.5%的灵敏度。使用标准的20ng DNA进行检测可以使一个等位基因频率的可重复量化精度达到0.25%。(图2)

总结

Naica™ Crystal数字PCR在造血干细胞移植后嵌合状态检测方面的优势：

☑  可与建立的SNV嵌合体检测方法完全兼容。

☑  使用Naica™系统进行的标准测试可使等位基因频率检测灵敏度降至0.25%，远低于0.5%的临床限值要求。

☑  此次研究，使用了Naica™系统中的高通量Opal芯片，一次可检测48个样本，每个样本可进行3荧光通道读取，仅需较低的DNA输入量，即可实现更高的样品通量和谱系特异性嵌合体检测的能力。

导读

反刍动物是指具有反刍习性的一类哺乳动物，如牛、羊、长颈鹿、兔子等。反刍动物采食一般比较匆忙，大部分未经充分咀嚼就吞咽进入瘤胃，经过瘤胃浸泡和软化一段时间后，食物经逆呕重新回到口腔，经过再咀嚼混入唾液并再吞咽进入瘤胃，这种行为称为反刍行为。反刍动物的食物种类比其他种类的动物更丰富，结构组成也更复杂，但草料中的粗纤维含量较高导致其难以消化，反刍动物依赖于胃部微生物群的代谢能力来消化各种物质，但其转化效率低也是养殖业广泛关注的问题。

虽然已有研究证明瘤胃中不同微生物的活性可以调节宿主利用植物生物能量的能力，但定植于宿主瘤胃中的微生物却很少受到关注。奥地利维也纳兽医大学的Cameron等人在Research Square在线发表了题为《Differential partitioning of key carbon substrates at the rumen wall by recently diverged Campylobacteraceae populations》的研究论文。文章采用多重数字PCR（dPCR）量化同一菌科的两种菌群，分析反刍动物瘤胃上的定植菌群分布及生物进化动态，为今后畜牧业提高动物代谢能力的研究提供了新思路。

应用亮点：

▶  宏基因组测序发现瘤胃上皮细胞中弯曲杆菌科两个种群的基因序列高度相似，利用naica®微滴芯片数字PCR系统可以对两个种群进行精准量化。

▶ 使用不同培养添加物后，可以利用naica®微滴芯片数字PCR系统进行微生物种群分布跟踪。

研究成果：

作者通过对瘤胃上皮微生物组的16S rRNA扩增子分析发现了一个优势菌株（OTU）为弯曲杆菌科（Campylobacteraceae），并通过宏基因组测序发现该OTU两个主要种群Ca. C. stinkeris与Ca. C. noahi的基因含量高度相似，但pgl（蛋白质糖基化）操纵子不同。

为了探究Ca. C. stinkeris与Ca. C. noahi两个种群空间分布的差异，作者通过naica^®微滴芯片数字PCR系统比较了这两个种群在不同动物瘤胃乳突离上皮壁最近和最远两个位置的含量。结果发现不同动物的两个种群在这两个位置的比例接近。

▲图1 Ca. C. stinkeris 和Ca. C. noahi在动物瘤胃乳突顶端和隐窝的含量比例。A）从乳突切片两个位置提取DNA使用dPCR进行定量分析。B) Ca. C. stinkeris 和Ca. C. noahi在动物瘤胃乳突两个位置的含量比例。横坐标为取样动物的名字。

然后作者使用naica^®微滴芯片数字PCR系统对两种菌群进行生长和适应性测定，数据显示Ca. C. stinkeris可以在以醋酸盐为主要碳源时积累的生物量，更好地生长，但被丙酸盐抑制，而Ca. C. noahiz在任何一种添加物存在的情况下在都没有检测到生长优势。因此，作者推断可能存在一些其他机制来最小化竞争，这种机制通过某些代谢生态位维度上的分化，防止它们生长动力学的重叠来支持两个种群的共存。

▲图2 醋酸盐利用和丙酸盐抗性检测。A)通过种群特异性dPCR，评估添加5 mM醋酸盐（acetate）或丙酸盐（propionate）对生物量积累的影响。分别用单个菌株(左，单一培养)和竞争菌株(右，共培养)进行了实验。

通过数字PCR这种定量技术，作者发现在瘤胃乳突的顶端和隐窝都分布有这两种优势菌群，且与上皮细胞分布数目无显著的相关性。另外，这两种菌群能够促进相关脂肪酸的代谢，进而发挥促进食物消化的功能。该文章为通过调节反刍动物体内某些盐离子浓度来调节优势菌群的分布比例进而提升消化能力提供了思路。

导读

除了在蛋白质翻译中的作用外，tRNA可以被切割成较短的生物活性片段，称为tRNA片段（tRFs）。来自精细胞的特定tRFs可以引起第二代小鼠中代谢紊乱。因此，种系细胞中的tRFs是表观遗传的一种机制，然而压力和毒素会导致tRFs模式的改变。华盛顿大学妇产科临床研究部的研究人员在MOLECULAR HUMAN REPRODUCTION上发表题为《Men who inject opioids exhibit altered tRNA-Gly-GCC isoforms in semen》的文章。本研究对注射类药物（一个重要的压力源）是否会影响生殖细胞中的tRFs感兴趣。研究者对来自注射阿pian类药物病人(PWID)和非药物使用对照组精液来源外泌体及精母细胞进行了RNA测序。测序后采用naica^®微滴芯片数字PCR技术验证数据，该技术的应用为药物滥用相关生育问题的研究提供了新的策略和方法。

阿pian药物滥用对生殖系统的影响一直备受关注。近期一项研究揭示了注射阿pian类药物的男性精液中tRNA-Gly-GCC外泌体的变化。该研究通过数字PCR技术检测tRNA-Gly-GCC外泌体，发现未注射阿pian类药物的男性与注射阿pian类药物的男性精液中tRNA-Gly-GCC外泌体存在显著差异。

tRNA-Gly-GCC外泌体在精子发生和成熟过程中扮演关键角色。研究结果表明，这些差异可能与精子质量和生育能力的下降有关。naica^®微滴芯片数字PCR技术在本研究中的应用，不仅提供了高灵敏度和高准确性的检测方法，对揭示阿pian类药物对生殖系统的影响具有重要意义。

应用亮点：

▶  naica^®微滴芯片数字PCR技术可以在RNA浓度低于检测下限的样品中检测两种tRFs形式。

▶ naica^®微滴芯片数字PCR结果与RNA测序结果具有很好的相关性，但比测序具有更高的灵敏度和准确性，有助于深入了解长期使用阿pian类药物的生物学影响。

研究结果：

▲图１.男性长期使用阿pian类药物导致精子中tRF-Gly亚型比例的变化,使用naica^®微滴芯片数字PCR技术定量tRFs。成熟精子细胞通过45-90% Percoll梯度纯化，并使用核苷素试剂盒分离小RNA。cDNA使用一种特定的茎环RT引物与“长”tsRNA亚型（53个核苷酸长）或另一种靶向“短”tsRNA变体（32个核苷酸长）的特定RT引物生成。（A）每微升cDNA中“长”tRF Gly-GCC亚型的浓度。（B）每微升cDNA中“短”tRF Gly-GCC亚型的浓度。（C）“长”与“短”tRF Gly-GCC亚型的比例。（D）每微升cDNA中miR100-5p的浓度。“C”：对照组（不注射药品的男性）;“PWID”：阿pian药物注射组。P值通过单尾曼-惠特尼U检验计算。对照组：n=10，PWID组：n=13。

研究发现，对照组中超过90%的reads到较短的Gly-GCC tRF，而在PWID中只有45%的读数。相比之下，对照组中只有4.1%的reads到更长的tRF，而PWID为45.6%。PWID的长/短tRF比显著高于对照组。同时发现精液来源的外泌体中小核仁RNA（snoRNA）表达差异。尽管无法确立PWID的发现与阿pian类药物使用之间的直接联系，但研究表明阿pian类药物注射和/或相关多药使用习惯和生活方式改变可能会影响表观遗传。这为阿pian类药物使用的可遗传影响提供了证据，并为进一步研究其跨代健康影响的机制奠定了基础。

数字PCR技术在研究PWID中差异表达的tRFs方面发挥了重要作用。由于精液中含有复杂的细胞混合物，意味着其中含有抑制剂，对于PCR的扩增有很大影响。但数字PCR有抗抑制剂干扰的特点，所以对于这类复杂样本的检测更为适用。文章中数字PCR和测序各自发挥了作用：测序用于发现长tRF和短tRF，而数字PCR则准确检测了tRF片段的表达差异，进而验证了测序的结果。这一发现表明，数字PCR在研究tRFs和其他非编码RNA片段方面具有显著的优势。数字PCR不仅可以在tRFs和其他类似的研究中提供更为精确的结果，还可以在诸如癌症、遗传学和传染病等领域发挥关键作用。

naica^®六通道数字PCR系统

法国Stilla Technologies公司naica^®六通道数字PCR系统，源于Crystal微滴芯片式数字PCR技术，自动化微滴生成和扩增，每个样本孔可实现6荧光通道的检测，智能化识别微滴并进行质控，3小时内即可获得至少6个靶标基因的juedui拷贝数浓度。

导读

在过去的几十年中，糖尿病的发病率在显著增长。除了不健康的生活方式外，环境污染物被认为是糖尿病发生的危险因素。多环芳烃 (PAH)是一类含有2-7个芳环的有机化合物，由自然和人类活动产生并广泛存在的污染物。流行病学研究表明，PAHs水平与成人和儿童的肥胖和二型糖尿病相关。

厦门大学生命科学学院细胞应激生物学国家重点实验室的研究人员在Ecotoxicology and Environmental Safety上发表了题为《Prenatal exposure to a mixture of PAHs causes the dysfunction of islet cells in adult male mice: Association with type 1 diabetes mellitus》的文章。文中应用naica®微滴芯片数字PCR系统对胰岛素编码基因DNA甲基化水平进行量化，揭示了产前暴露于多环芳烃混合物对成年雄性小鼠胰岛细胞功能的不良影响。

应用亮点：

▶  使用naica®微滴芯片数字PCR系统对胰岛素编码基因启动子甲基化水平进行量化。

▶ 在产前暴露于500µg/kg PAHs的小鼠中，胰岛素编码基因启动子的甲基化水平显著升高。

▶ 产前暴露于PAHs可能促进I型糖尿病的发病。

作者使用8种PAHs的混合物进行了实验，以研究产前PAHs对成年期胰岛细胞功能和质量的影响，同时试图阐明 I型糖尿病发病的环境原因。他们分离了成年雄性小鼠的胰岛，对胰岛素编码基因的启动子DNA甲基化水平进行分析。

研究成果：

▲图1. 产前暴露于多环芳烃对成年雄性小鼠胰岛素编码基因甲基化水平的影响。(A) 数字PCR结果代表性一维图。(B)胰岛素编码基因启动子甲基化水平。(每个处理三只母鼠, 每只母鼠取一个雄性后代) 。

在本研究中，子宫内暴露于500µg/kg PAHs的小鼠胰岛中胰岛素编码基因启动子中的DNA甲基化水平显著增加，同时胰岛素编码基因转录显著下调。

▲图2. 不同PAHs浓度对胰岛素编码基因转录水平的影响

期刊介绍：

Ecotoxicology and Environmental Safety 1977创刊，隶属于爱思唯尔出版集团。是一份多学科交叉期刊，主要研究环境污染对包括人类健康在内的生物体的暴露和影响。最新影响因子为7.129。

naica®六通道数字PCR系统

法国Stilla Technologies公司naica®六通道数字PCR系统，源于Crystal微滴芯片式数字PCR技术，自动化微滴生成和扩增，每个样本孔可实现6荧光通道的检测，智能化识别微滴并进行质控，3小时内即可获得至少6个靶标基因的绝对拷贝数浓度。

导读

据报道，截至目前两台“奶茶“Naica全自动微滴芯片式数字PCR系统正式在上海交大落户啦-上海交通大学生物医学工程学院和上海交通大学分析测试ZX，感谢上海交大各位老师们的大力支持，顺利完成安装培训并启用！

不需要标准品可以对低拷贝基因定量，对微小差异的基因进行分析，对含YZ剂的样本进行准确定量等，弥补了二代PCR技术也就是荧光PCR的不足。目前数字PCR技术已经应用在肿瘤学研究、NIPT研究、液态活检、基因编辑、细胞ZL质控、用药及移植监控、致病微生物检测、食品安全、环境检测、核酸类标准物质定量等方面。

此次“奶茶”Naica系统的顺利使用支持其科研团队在分子与纳米医学领域，聚焦重大临床早期诊断和疾病预后等专项科研成果的转化医学研究，攻克关键技术难题，推进 “产学研医”有机结合的科技成果产业化进程。

“奶茶”Naica系统的落户可为核酸定量、生物医学研究、水质检测、食品检测、转基因成分检测、环境污染物分析等多方面检测提供更可靠的平台。

非常感谢用户对我们的平台的认可，同时也希望”奶茶“Naica全自动微滴芯片数字PCR为越来越多的用户检测提供更便捷，更可靠的技术。

更多“奶茶“Naica数字PCR信息可登陆www.cycloudbio.com查看。同时由法国Stilla Technologies公司开发Gene-π作为数字PCR学习交流平台，为您全方位解读数字PCR技术，为用户提供数字PCR技术信息，您也可以选择感兴趣的应用教程，其中包含从实验设计到数据分析的详细工作流程。您还可以通过搜索导航工具直接搜索特定的项目（"dPCR的DNA准备"，"荧光溢出"等），或点击我们的"HOW TO" 选择您需要的部分（设计、分析、报告）。详细信息可登陆网站：https://www.gene-pi.com/查看。