ISCO培训--Prep SFC方法开发的新技术

制备型超临界流体色谱(SFC)的方法开发技术既费时又有限。为了解决这一挑战，Teledyne ISCO正在应用之前开发的快速色谱和预处理色谱技术，以大大减少方法开发时间。在本次网络研讨会上，应用化学家Jack Silver介绍了一种基于分析系统或制备SFC平台上单个检测梯度的结果快速开发制备SFC方法的新方法。

讨论的话题

• 新型ACCQPrep SFC系统概述

• Prep SFC方法开发基本理论

• 使用聚焦梯度vs.等梯度方法

• 如何将计算的聚焦梯度转换为等梯度方法的叠加注射进样

• 通过检查探测梯度的峰值形状来预测聚焦梯度的质量

• Prep SFC故障的排出方法

从这个45分钟的演讲和交互式问答环节，参会者将能够显著减少SFC制备应用的方法开发时间，同时也节省溶剂和其他资源。学习如何在任何时候联系Teledyne ISCO的色谱支持团队，以帮助Prep SFC仪器的操作和方法。

会议参与时间与参与方式

请复制以下链接，或扫描下方二维码，自行注册参加：

1.北京时间2月22日 21：00

https://teledyne.zoom.us/webinar/register/1716402039720/WN_MruCv1gVR0O4xlVND8JWvw?timezone_id=Asia%2FShanghai

在任何药物研发进程中，实验方法的设计和优化对新药研发的成功性而言至关重要。我们需要考虑的因素包括：选择Z合适的检测技术，读取模式，和实验模型（生物化学，细胞或动物）。通常，这些因素会影响数据质量，生物相关性以及ZL的可预测性，Z终将影响整个临床前药物开发工作的成败。

方法技术的选择

diyi步是确立解决实验问题的技术，例如激活，YZ或调控靶标、阐明MOA（作用机制）、确定受体 - 配体或蛋白质 - 蛋白质的相互作用、鉴定和定量疾病特异性生物标志物或血浆中的生物标志物成分。

样本基质的兼容性

生物标志物测定旨在检测或定量生物学中的靶标样本(例如，复杂基质）中的含量，这种负责基质涵盖范围有：细胞培养中的分泌蛋白，细胞裂解液，组织提取物，唾液，尿液，血清，血浆，血液的上清液，或其他液体（例如，CSF，BALF）。分析技术可能并非总是如此。某些实验方法在某些基质中存在干扰而不适用。例如，在血清，血浆或血液中的血红蛋白表现出广泛的可见光谱吸光度，即在350和600nm之间。检测方法中，依赖于这些波长的激发或发射将容易发生干扰。基于洗涤的检测方法可以避免由于过多复杂基质引起的干扰，因为干扰物质在洗涤过程中被冲走。为了确定基质的相容性，在合适的稀释液中的加标回收和标准曲线是传统的验证方法。

同时，在复杂体系中的抗体选择也是非常重要的，靶标蛋白可能被修饰或者酶切，影响抗原识别位点，因此，加入蛋白酶YZ剂也是有必要的。

实验效果 ：灵敏度和动态范围

 一个实验的灵敏度决定了其在动态范围内的对其靶点的检测的“分辨率”，同时预警了不同批次批次之间的Z低检测范围的差异性。灵敏度同时也依赖于检测样本。血清中的检测难度高于细胞水平。同时“珍贵样品”如有限的细胞或者组织会决定测试的容许体积等。方法技术也会影响检测灵敏度，如发光和荧光的模式比吸收光的模式的灵敏度要好。

动态范围定义了检测下限和上限。例如下图所示，不同的检测技术对于肿瘤坏死因子TNF的检测动态范围达到了数量级的差异。因此，当样品含量超过了其实验方法的动态范围，其浓度，动力学参数，活性，结合力将不准确。因此，需要预先滴定检测窗口以免达到饱和。

下图展示了不同实验技术对于不同的亲和力的适用范围：

特异性

特异性对于确保筛选靶向的靶点或表型非常重要。对于免疫分析，需要考虑针对靶向分析物特异性的抗体，特别是对于靶向蛋白质的部分修饰新表位变化,结合/未结合或活性/非活性状态。此外，还需要考虑物种和靶点的交叉反应性。

稳定性和准确性

尽管信号强度和和性噪比（S/B）通常被用来评估一个实验的质量，可重复性和准确性也是非常重要的。Z’是一个非常好的评判标准。例如，相对而言，高Z’而低信噪比的实验方法好于低Z’高性噪比的实验方法。与此同时，实验发法应当具有高重复性，定量实验应该有标准品做参照。设置好对照，好的标品，抗体，阳性化合物对于建立可靠的实验是非常重要的。

试剂和其他耗材

对于免疫实验来说，高灵敏度和搞特异性的抗体非常重要，同时还有对应的酶或重组蛋白。通常，所有的实验成分，例如细胞、蛋白、酶、辅因子、底物、激动剂，拮抗剂等都需要进行浓度滴定以确定Z优浓度。该过程能够确保稳定的动力学研究以及防止过饱和浓度而产生的试剂浪费。（如下图）

细胞模型

在选择细胞模型时，应考虑使用原代细胞与重组/永生化细胞系的优缺点，以及研究内源性与重组表达的靶蛋白。同时需要评估目标蛋白的表达水平，因为过多或过少的表达会影响灵敏度和分析质量。细胞传代和培养条件也会影响实验质量。

微孔板的选择

正确选择微孔板可以减少交叉效应、降低背景、降低信号吸收或放大信号强度。下表显示了基于检测方法的微孔板选择矩阵。

众所周知，药物研发花费巨大，耗时长。优化已知影响数据质量、生物相关性和ZL可预测性的实验因素Z终推动整个临床前药物开发工作的成功。选择Z合适的分析技术、读取模式和实验模型以及优化实验方案为成功和经济有效的药物开发奠定基础。

我们珀金埃尔默能够提供多种实验方法开发的解决方案。例如，我们拥有的均相的Alpha技术以及TRFRET技术，时间分辨defia技术，化学发光技术，细胞增殖和毒性试剂盒，各类GPCR以及动物模型的探针细胞株，微孔板等试剂耗材，能够助力您新药研发的各个环节。

珀金埃尔默能够提供多种实验方法开发的解决方案，欢迎大家关注“珀金埃尔默生命科学”微信公众号了解更多解决方案，期待您的垂询！

关于珀金埃尔默：

珀金埃尔默致力于为创建更健康的世界而持续创新。我们为诊断、生命科学、食品及应用市场推出独特的解决方案，助力科学家、研究人员和临床医生解决Z棘手的科学和YL难题。凭借深厚的市场了解和技术专长，我们助力客户更早地获得更准确的洞见。在，我们拥有12500名专业技术人员，服务于150多个国家，时刻专注于帮助客户打造更健康的家庭，改善人类生活质量。2018年，珀金埃尔默年营收达到约28亿美元，为标准普尔500指数中的一员，纽交所上市代号1-877-PKI-NYSE。

了解更多有关珀金埃尔默的信息，请访问www.perkinelmer.com.cn。

    Teledyne ISCO 9月29日举办网络研讨会，色谱技术专家Jack Silver将讨论如何及何时使用“全波长采集、基线校正和ESLD温度设置”来解决困难的应用；在45分钟的内容介绍和互动问答环节中，与会者将对检测器设置的影响以及将其应用于复杂的flash应用程序的能力有了新的认识。虽然培训内容主要关注Teledyne ISCO快速色谱系统的检测设置，但其他品牌的用户也将会发现有用的信息。感兴趣的同行朋友可选择合适的时间注册参加。


会议内容
    调整检测方法中几个关键参数，以提高色谱检测结果。还可扩大溶剂的选择范围，避免洗脱过程中化合物检测吸收峰饱和情况，以及减少目标化合物的损失。在这个先进的网络研讨会这个媒介上，Jack Silver将讨论如何以及何时使用“全波长采集、基线校正和ESLD温度设置”来解决困难的应用。

紫外检测方法

• 波长的选择，以提高方法的灵敏度

• 基线校正和全波长采集技术

• 使用全波长收集和基线校正来扩大兼容溶剂的范围

• 提高洗脱的分离度

• 在天然产物中发现更多未知化合物

• 提高检测紫外峰和收集化合物馏分对应相关性

蒸发光散射检测

• 使用温度设置来改善化合物收集的技术

• 不同溶剂的ELSD温度设置

• 喷雾室和漂移管设置，以提高ELSD灵敏度

• 关于低熔点化合物的ELSD检测的局限性

会议时间及参与方式
选择北京时间9月29日晚20:00-21:00，请点击下链接，自行注册参加：
https://teledyne.zoom.us/webinar/register/WN_hphAyaqjT8S8Zey7L_xJqA 

选择北京时间9月30日早上9:00-10:00，请点击下链接，自行注册参加：https://teledyne.zoom.us/webinar/register/WN_kxgDXkfYThKC45KvluhH0Q

使用ACE方法开发工具包(MDKs)进行色谱柱筛选

方法开发的四个简化步骤
• ACE MDKs包括了为互补选择性而精心设计的3支色谱柱。
• 色谱柱筛选是一种简单而又功能强大的方法, 可以快速识别Z合适的色谱柱。
• 通过筛选2种不同的流动相有机改性剂可以使方法更全面。
• 以下的流程图总结了如何通过4个简单步骤执行方法开发筛选。

开始

diyi步：选择流动相pH和缓冲液
根据分析物性质 (即pKa, logP和logD数据) 进行选择。对于未知分析物，使用酸性流动相作为起点。

第二步：使用ACE 方法包 (3或6支色谱柱)
梯度扫描以MeOH和MeCN作为有机溶剂,进行5-95％梯度筛选。

第三步：查看数据

选择Z佳色谱柱和有机改性剂。

第四步：方法优化

如有必要, 检查温度, pH值, 梯度斜率,梯度范围等。

是否实现分离？

是-方法开发完成

否-改变流动相条件（pH值,缓冲液等），回到第二步继续实验。

选择色谱柱和粒径尺寸。
由LC系统和用户的偏好决定。对于400 bar的HPLC系统来说, 5μm 150 x 4.6mm是个不错的选择。
对于600 bar优化的HPLC系统, 可使用2 和3μm粒径的较短色谱柱 (如100mm)。1.7μm粒径的短柱 (如50mm)适用于UHPLC系统。

如何确定合适的筛选梯度时间？
梯度时间可以使用公式1计算。
VM可用公式2计算。

请务必记住在下一次注射前, 在梯度洗脱后以至少10倍VM (柱内体积) 进行一次等度重新平衡。

为何使用色谱柱筛选？

• 改变色谱柱的固定相可能对选择性造成显著影响 (图1)。
• 在相同的流动相条件下, 筛选不同的色谱柱可以帮助您以更高的分辨率更快地实现所需的分离。

图1：改变色谱柱固定相的影响。
色谱柱：50x2.1mm

流动相：A = 0.1％甲酸的水溶液，B = 含0.1%甲酸的甲醇:水(9:1 v/v)

梯度：5分钟内3-B，
流速：0.06mL/min

温度：40°C

检测：UV，254nm

样品：1）甲硝唑，2）苄醇，3）氢氯噻嗪，4）香草醛，5）羟苯甲酯，6）1,2-二硝基苯

• ACE MDKs将具有不同相互作用机制的色谱柱组合在一起, 以Z大限度地提高选择性并增加分离具有挑战性的混合物的可能性。
• 性价比高, ACE MDKs与单支色谱柱价格相同！
• 两种Z受欢迎的ACE反相 (RP) MDK (参见下表) 包括了为利用不同的保留机制和Z大化选择性而独特设计的相。
• 所有六个相都可以在反相 (RP) 条件下使用, 并且具有与C18一样的稳定性。

1近似值– 通过半定量机制加权和/或通过参考使用>100特征分析物的其他ACE相来确定。

• 其他的ACE方法包还有HILIC分析包, 生物大分子300Å分析包和实心核(UltraCore) 分析包
• 同样提供微孔柱尺寸 (内径0.5和1.0mm)。

成功范例
对乙酰氨基酚及有关物质

ACE反相系统性方法开发方案

近年来USP和ICH都针对分析方法开发与验证进行了修订。USP新收录通则<1220>分析方法生命周期已于2022年5月1日生效，分别从分析方法开发、分析方法性能确认及分析方法使用三个阶段分别阐述如何在分析方法整个生命周期内对方法进行管理。而ICH Q14分析方法开发和Q2(R2) 分析方法验证的修订也进入到了第三阶段，按照计划其将在2023年5月前完成阶段的定稿。这些信息都表明了分析方法开发和验证的管理将会变得更严谨、更科学。

因为色谱仪器包括色谱-质谱联用技术在药物开发过程中的广泛使用，色谱分析方法的开发与验证也成为了方法开发与验证，乃至分析方法生命周期管理中的重要内容。针对色谱方法开发与验证的整体流程，可以将其大致分为：方法筛选、方法优化、耐用性测试和完整的方法验证这四个阶段。

而这四个阶段都离不开仪器准备、队列运行、数据查看与处理以及报告这几个环节。赛默飞的旗舰版色谱数据系统Chromeleon 软件功能丰富而注重实践，能够帮助实验室的色谱分析实现精简、高效的工作流，以实现更快的样品到结果的转换。

自定义变量的灵活应用

在Chromeleon CDS 中创建队列时可以通过手工填写的传统方式，也可基于事先建好的队列模板。值得一提的是Chromeleon 强大的样品列表功能。除了运行样品的基本信息（样品名称、仪器方法、运行的其他必须参数）之外，还可以通过自定义变量的形式，添加额外的注释信息，例如色谱柱类型、缓冲液名称等用于清晰识别每一针进样的信息。

使用者还可以进一步创建一些自定义变量并将其与仪器方法中的参数进行链接，更加简单地实现实验设计（DoE）的环节。一旦基本方法固定，便可通过改变色谱柱选择阀或溶剂选择阀等参数实现不同要素的组合以寻找具备可行性的色谱条件，也体现了ICH和USP所倡导的“多变量分析方法开发”这一方针。相比传统的样品队列创建方式，减少了所需创建的仪器方法的数量，并以清晰直观的模式展示了所使用的变量以及变量值，结合缩略图功能提供了更直观的信息。

在数据处理阶段，可以再次利用Chromeleon 样品列表中的自定义结果变量功能，可以方便地实现运行样品的同时进行结果计算，例如系统适用性参数的计算，峰面积、含量以及测试是否通过等信息的显示，帮助使用者快速查看所需信息以便灵活调整实验的方向。

完全可定制的

Chromeleon

报告模板也支持自定义变量、公式和计算，使用者可以使用内置的模板，也可以根据需要进行调整，得到包括多个工作表、结果表和图形的报告，无需导出到其他软件，也无需手动计算，从而消除转录错误。所有报告和计算都可以在合规的环境中完成，并在源数据发生变化时自动更新。可以选择在运行结束时自动打印、导出也可以发送电子邮件通知给相关人员。

更便捷的eWorkflow

Chromeleon 也提供一个创建序列、运行并得到结果的简单而直接的方法，这就是eWorkflow。它最 大限度地减少了操作步骤并涵盖了色谱或 MS 工作流程的所有方面，定义了可以在哪些仪器上运行分析以及应该使用哪些方法和文件，包括仪器方法、处理方法、报告和外部文件，例如 SOP。 

与前面提到的自定义变量等有效结合，只需单击几下即可创建复杂的序列并立即运行，并在运行后得到所需的报告。这些都可以减少错误、更快地产生可靠的结果，并且显著减少了培训的需求，有效加速了方法开发的流程。

分析方法验证工具包

ICH指南定义了方法验证应该执行包括专属性、准确度、精密度、检测和定量限度、线性、范围和耐用性的测试。除了样品运行的环节之外，计算、整理和报告验证结果也可能需要很长的时间，而且大多数测试都涉及将结果与指标进行比较，相对比较繁琐。 

在eWorkflow的基础上，Chromeleon 又提供了一个方法验证的高效工具，ICH方法验证扩展包。扩展包内有一系列的模板，每个模板都包含处理方法、报告模板和自定义变量以覆盖所需的变量和参数。所有这些都在 eWorkflow 程序中捆绑在一起，以确保正确执行ICH所要求的相关测试，减少人为错误并加速流程：eWorkflow 可以引导创建队列，自动执行所有计算，并通过报告直接显示通过或失败的结论。

以上介绍的几个工具仅为Chromeleon 强大功能的冰山一角。结合Chromeleon 实用的多厂商仪器控制能力，出色的系统适用性和智能运行控制功能，便捷的数据积分、处理功能，直观的图形化显示，全面的合规能力，Chromeleon不但可以提升方法开发、验证的效率，也一定能够帮助色谱工作者执行分析方法生命周期的管理。

    “小暑不算热，大暑正伏天”，随着大暑节气的到来，江西全境高温肆虐。由青岛明华电子仪器有限公司举办的《2019江西省环境监测新技术新标准宣贯培训会》于7月26日在南昌市成功举办，200多名学员无惧酷暑与明华电子共同学习进步。

      此次会议，青岛明华邀请多位业内ZS环保专家，从废气污染监测出发到环境空气质量监测再到VOCs多种检测技术，多方位、多角度、广深度的给各位学员带来新标准、新政策的宣讲及各项新技术的深入讲解。

      现场气氛活跃，讲师与学员互动积极，特别是在β射线吸收法烟尘直读新技术讲解环节，学员争相提问。应学员要求，明华电子工程师现场演示了我公司新产品 - MH3300型 烟气烟尘颗粒物浓度测试仪的多项功能，新产品新技术给学员们带来了全新的使用体验。

    “共赢互惠，诚信永恒”，明华电子将持之以恒，以更饱满的热情投身于环保监测行业，为中华环保事业添砖加瓦！

PeakTrak®软件和ACCQPrep®SFC可让您非常轻松的创建堆叠注入。

叠加进样可以增加每天净化的样品量。这是通过利用进样后峰洗脱所需的时间间隔来注入更多的样品，这样就有一系列的进样顺着柱子进行洗脱。

当一个化合物需要从紧挨着的杂质中洗脱分离出来时，叠加进样是最有用的，这个杂质的存在需要一个降低柱负荷量来减少重叠的峰。虽然这种情况通常发生在手性化合物上，但非手性纯化，如多肽、天然产物和有机合成也受益于叠加进样。PeakTrak软件和ACCQPrep SFC可以让您非常容易的创建叠加注射液!

在这个45分钟的网络研讨会上，您将学到：

• 为什么要进行叠加进样？

• 叠加进样是如何工作的？

• 哪些样品适合于叠加进样？

• 使用CombiFlash® NextGen flash色谱系统准备样品进行叠加进样

• 在您的ACCQPrep SFC系统上设置叠加进样

本次网络研讨会由Teledyne ISCO产品线经理-医药研发产品的Joshua Lovell和Teledyne ISCO应用化学家Jack Silver主讲，您有机会聆听两位领先的色谱专家演讲，并在互动问答中讨论您的具体应用需求。

我们期待您的到来！

会议参与时间与参与方式

请您识别下方二维码，自行注册参加：

1. 北京时间11月8日 21：00

2. 北京时间11月9日 10：00

凝胶渗透色谱法是体积排阻色谱法的一种，以水或者缓冲液为流动相；以有机溶剂为流动相的一般叫凝胶过滤色谱法。

两者都属于体积排阻色谱法（Size exclusion chromatography，SEC）。SEC是20世纪60年代发展的一种分离模式。它是根据空间结构不同的分子在多孔颗粒中的路径不同而进行分离。原理如下

原理

看完原理给我们就有了一个小的tips啦:

tips 1

分子直径比最 大孔隙直径大的分子全部被排阻在凝胶颗粒以外，两种或两种以上的这样的分子不能达到分离效果。

tips 2

分子直径比最小孔隙直径小的分子能全部进入凝胶颗粒内部，这样的两种或两种以上的分子也不能达到分离效果。

应用领域

生物药质控

•单抗
•双抗
•ADC
•融合蛋白
•血液制品
•重组白蛋白
•糖蛋白
•PEG蛋白
•多肽
•多糖
•纤维素

生物药工艺监控

•单抗
•双抗
•ADC
•融合蛋白
•血液制品
•重组白蛋白
•PEG蛋白
•多肽

辅料和残留分析

•吐温80/20
•聚乙二醇
•泊洛沙姆
•聚乙烯吡咯烷酮

食品化药领域

•水溶性抗生素聚体分析
•乳品中乳白蛋白和乳球蛋白分离
•中药中吐温20/80

不同的样品由于空间结构不同，在同一根柱子上的排阻范围不同。参考选用跟标准品结构最相近的排阻范围内的柱子。如下BIOBASIC系列SEC色谱柱的不同标准品的校准曲线如下：

方法开发考虑因素

1、孔径分布

相近孔径分布的柱子，在检测同一个样品时，聚体与主峰或者主峰与片段的分离可能会存在比较大的差异。

2、粒径

不同的粒径的相近孔径分布的柱子，分析需要的柱长和分析时间会有差异。

3、缓冲体系

缓冲体系中流动相的组成，pH值可能会改变蛋白的三维结构和折叠状态，进而影响单体，片段与聚体的分离。

4、盐浓度

由于包裹技术的差异，样品可能会跟色谱柱之间存在一些离子性吸附，这个时候，需要提高流动相中盐的浓度来屏蔽这种作用。Mabpac SEC 系列优异的包裹技术，可以在比较低的盐浓度下分析蛋白样品，进而用于Native 质谱方法开发。

仅仅给出方法开发tips怎么能表达我们的诚意呢，我们更推出了免费SEC做样的服务，快快扫描以下二维码报名参加吧：