AOAC 2001.02 低聚半乳糖测定方法改进

近些年来随着健康意识的提高，人们对于食品添加剂和膳食补充剂的兴趣不断增加，如低聚半乳糖等益生元开始引起人们的关注。

食品和食品补充剂中低聚半乳糖的含量必须满足安全和相关法规的要求，如 GB 14880-2012 《食品安全国家标准 食品营养强化剂使用标准》中规定婴幼儿谷类辅助食品和婴幼儿配方食品中低聚半乳糖（乳糖来源）、低聚半乳糖（乳清滤出液来源）含量不得超过64.5g/kg。目前对于低聚半乳糖的检测，应用最广泛的是通过酶水解将其分解为小分子糖，然后进入色谱分析。

目前国内低聚半乳糖的标准检测方法尚未正式发布，因此本文以 AOAC 2001.02 方法为蓝本进行描述并改进。使用配有安培检测器的瑞士万通离子色谱（IC-PAD）可对低聚半乳糖进行全自动分析。

什么是低聚半乳糖?

低聚半乳糖为在葡萄糖或半乳糖分子上链接1~7个半乳糖基的碳水化合物，是食品和饮料中少量天然存在的益生元。低聚半乳糖最初在人类母乳中发现，是母乳中的主要成分，其含量高达12g/L，因此被添加到婴幼儿奶粉中作为益生元补充剂。低聚半乳糖可以在肠道中表现出双岐化作用，调节肠道菌群，支持非致病细菌的生长。

食品标签对低聚半乳糖的要求

全 球益生元和低聚半乳糖市场的增长来自于消费者健康意识的提升，为回应这种意识提升，EU 1169/2011 和 EU 2015/2283 以及 GB 14880-2012 都对其含量做出了规定。因此我们必须对食品和营养补充剂中的低聚半乳糖进行测定。

低聚半乳糖对人体健康影响的研究表明，每人每天摄入的低聚半乳糖建议不超过30g，婴幼儿配方奶粉则需要执行更加严格的规定。

AOAC 2001.02

目前测量食品中低聚半乳糖最常用的方法就是 AOAC 标准方法 2001.02，国内相关标准的征求意见稿也是以此为参考。该方法是将低聚半乳糖从食品中提取出来之后将其水解为单糖，然后使用带有安培检测器的阴离子交换色谱进行分析。

AOAC 2001.02 方法是将提取液与用β-半乳糖苷酶处理的水解液进行比较。在β-半乳糖苷酶催化下，糖苷键断裂，低聚半乳糖和乳糖水解成葡萄糖和半乳糖。两种溶液中测定的游离半乳糖和乳糖的浓度差即可用来计算低聚半乳糖含量（图1）。

图1. 根据 AOAC 2001.02 方法测定低聚半乳糖含量的示意图，以及瑞士万通优化后的方法(绿色)。

对AOAC方法的改进

AOAC 2001.02 的样品制备过程相当复杂：一方面是对照提取液需要加入昂贵的失活酶以维持提取液中各种糖浓度不变（图 1）；另一方面，样品是使用乙腈溶液稀释，而标准品则是用超纯水制备。

本文中我们将简化整个过程以提高方法的易用性和分析效率。

实验证明，在提取溶液中添加失活酶与否并不会影响提取物中葡萄糖、半乳糖和乳糖浓度，因此我们取消了该步骤，节省了大量的费用和手工劳动。总低聚半乳糖含量的测定，仅需测量不含任何酶的提取液和添加了活性酶的水解液即可完成。

图2. 某品牌益生元补充剂未处理(黑色)和酶处理(橙色)的叠加色谱图。

应用报告

“如果想要了解更多分析细节

您可以识别左侧二维码

下载相关应用报告AN-P-087

除了酶的使用，AOAC 方法还建议在超纯水 (UPW) 中制备标准品，而用 20% 乙腈稀释实际样品。我们按照以下条件做了对比试验：

◆ 使用纯水做校准曲线，纯水稀释样品（纯水）

◆ 使用纯水做校准曲线，乙腈稀释样品（AOAC方法）

◆ 使用乙腈做校准曲线，乙腈稀释样品（乙腈）

在以上三个条件中，低聚半乳糖含量的重现性在纯水和 AOAC 方法之间表现类似，而乙腈方法中低聚半乳糖含量低于其它方法，乙腈似乎对样品并不具有稳定作用。因此我们可以使用纯水对样品进行稀释来改进 AOAC 方法，减少化学试剂的使用。

结果

总体而言，改进后的方法在分离度、回收率以及特异性方面表现出很好的稳定性，半乳糖检出限为 0.1mg/L，葡萄糖和乳糖为 0.2mg/L，可以满足低浓度样品的测量需求。

总结

在糖类分析方面带有安培检测器的离子色谱法是一种灵敏、稳定且选择性非常好的多组分分析方法，而且无需任何额外的衍生步骤。结合酶处理，离子色谱可以对非常复杂的糖类进行分析。

本研究对食品中低聚半乳糖测定的 AOAC 方法进行了优化，虽然原理相同，但是分析效率得到大幅提升，可以大大降低实验室时间和运行成本。如使用其它自动化样品处理技术，如英蓝逻辑稀释技术和英蓝自动校准技术，还可进一步提升工作效率。

细菌内毒素检测是一项关键的QC放行检测，这意味着生物制品只有通过该项测试才能向公众放行使用。过去30年来，内毒素检测一直使用从鲎中提取的鲎试剂，检测药品和疫苗。在这段时间里，内毒素检测和技术几乎没有变化，直到最近才有了极小的改进。业界已经看到了传统内毒素检测的弊端，并表达了很多理由，为什么改进内毒素检测会非常有用。业内通过采用创新技术来寻求改进内毒素检测，这些创新不仅可以减少检测时间，还可以提高数据可靠性，以便更有效、更安全地将产品提供给患者。

使用传统的凝胶法和96孔板方法有一些注意事项。这些陈旧的技术都是手动的，需要分析员在QC实验室里花大量时间操作。需要的人工干预越多，内毒素检测就越容易出现错误。凝胶法是一种定性测试，也就是一种合格或不合格的测试。96孔板动力学方法是凝胶法的升级版，因为这些测试是定量的、半自动化的。但这些方法仍需要大量时间来设置和执行，并容易出现一系列的错误。

内毒素检测

是一项非常敏感的测试，可检测到低至万亿分之一的内毒素（相当于奥林匹克标准泳池中的一粒沙子）。这种检测手段灵敏度非常高，但也意味着用户造成的任何类型的小污染都很可能会被检测到。药企希望更快地将他们的产品推向市场以帮助患者，因此如果由于污染导致内毒素检测失败或无效，这将需要重新检测、调查原因，并最 终延迟向有需要的患者放行此产品的时间。

细菌内毒素检测是一项关键的QC放行检测，这意味着生物制品只有通过该项测试才能向公众放行使用。过去30年来，内毒素检测一直使用从鲎中提取的鲎试剂，检测药品和疫苗。在这段时间里，内毒素检测和技术几乎没有变化，直到最近才有了极小的改进。业界已经看到了传统内毒素检测的弊端，并表达了很多理由，为什么改进内毒素检测会非常有用。业内通过采用创新技术来寻求改进内毒素检测，这些创新不仅可以减少检测时间，还可以提高数据可靠性，以便更有效、更安全地将产品提供给患者。

使用传统的凝胶法和96孔板方法有一些注意事项。这些陈旧的技术都是手动的，需要分析员在QC实验室里花大量时间操作。需要的人工干预越多，内毒素检测就越容易出现错误。凝胶法是一种定性测试，也就是一种合格或不合格的测试。96孔板动力学方法是凝胶法的升级版，因为这些测试是定量的、半自动化的。但这些方法仍需要大量时间来设置和执行，并容易出现一系列的错误。

内毒素检测

是一项非常敏感的测试，可检测到低至万亿分之一的内毒素（相当于奥林匹克标准泳池中的一粒沙子）。这种检测手段灵敏度非常高，但也意味着用户造成的任何类型的小污染都很可能会被检测到。药企希望更快地将他们的产品推向市场以帮助患者，因此如果由于污染导致内毒素检测失败或无效，这将需要重新检测、调查原因，并最终延迟向有需要的患者放行此产品的时间。