前沿 | 细胞能量分析与代谢表征助力线粒体铁硫簇调控因子的突破性发现

铁硫簇（iron–sulfur cluster，铁硫簇）是生物演化过程中最 早出现的、介导氧化还原反应的一类蛋白辅助因子，广泛存在于线粒体、细胞质及细胞核蛋白中，对 DNA 复制与修复、线粒体呼吸、蛋白翻译及铁稳态维持等生命过程至关重要。在哺乳动物中，铁硫簇合成障碍与多种遗传性疾病密切相关，而铁硫簇生物合成的上游调控机制，尤其是是否存在未知线粒体因子参与该合成代谢过程，至今尚未被完全阐明。

2025 年 12 月 18 日，清华大学基础医学院朱佳俊课题组联合中国科学院上海营养与健康研究所潘巍峻课题组，在《Molecular Cell》期刊（IF=19.3）发表题为 “The TIM22 carrier translocase supports cell proliferation by facilitating mitochondrial iron uptake for Fe-S biogenesis” 的研究论文。该研究首次发现线粒体载体转运酶复合体 TIM22 是铁硫簇（Fe-S）生物合成的关键调控因子，其通过介导线粒体铁转运蛋白的正确定位，保障铁硫簇合成所需铁离子供应，进而支持细胞增殖。该研究为 TIM22 复合体亚基突变相关神经肌肉症等疾病的致病机理解析及临床治疗策略开发提供了全新线索。

整体研究策略

系统化筛选铁硫簇生物合成调控的候选线粒体因子

构建体外细胞模型验证调控因子作用

明确候选因子参与铁硫簇合成的调控环节

验证候选因子的体内生物学功能

研究结果

铁硫簇生物合成相关基因筛选系统：CRISPR 报告基因系统

图 1. CRISPR 筛选流程图。在表达 IRP2-EGFP 融合蛋白 HEK293T 细胞中，通过线粒体靶向 sgRNA 文库开展 CRISPR 基因敲除，若被敲除基因与铁硫簇（Fe-S）生物合成相关，FBXL5 泛素连接酶（E3）活性会受抑制，进而导致 IRP2-EGFP 融合蛋白发生累积。借助流式细胞术分选并收集绿色荧光蛋白（EGFP）高表达的前 20% 细胞。通过 gRNA 测序获得确定候选基因。

铁硫簇生物合成通路候选调控因子：线粒体载体转运酶复合体 TIM22

研究团队通过 CRISPR 基因编辑及报告基因筛选实验，发现 TIM22 复合体组分（包括 TIMM29 和 TIMM10）可能参与了铁硫簇生物合成代谢通路；通过构建基因缺陷细胞株，进一步发现这两个复合体组分功能缺失会导致铁硫簇生物合成受损。

图 2.（左）候选基因火山图。（右）Western Blot 分析 HEK293T 细胞系中 TIM 复合体组分（TIMM29 和 TIMM10）表达缺陷对铁硫簇簇合成的影响。

线粒体电子传递链的正常功能依赖多种含铁硫簇蛋白及其铁硫簇的电子接受和传递能力，其中，铁硫簇生物合成受损会影响电子传递链的功能。研究团队采用了 Agilent Seahorse XFe 96 能量代谢分析仪对 TIM22 复合体组分缺陷的细胞氧气消耗率 (OCR) 进行了测定，发现与对照细胞相比，TIM22 复合体组分缺陷细胞氧气消耗率显著下降，说明电子传递链功能受损，这与细胞中铁硫簇生物合成受损一致。

图 3. 通过 Seahorse 能量分析仪检测 TIMM 复合体组分缺陷下 DLD1 细胞的氧耗率 (OCR)。细胞先后经过下面三种药物处理：ATP 合酶抑制剂寡霉素（Oligomycin）、氧化磷酸化解偶联剂羰基氰-4 (三氟甲氧基)苯腙（FCCP）及电子传递链抑制剂鱼藤酮 / 抗霉素 A（Rot/Anti-A）。

TIM22 复合体通过维持线粒体 Fe²⁺ 摄取，促进铁硫簇合成，进而支持细胞增殖

线粒体中铁硫簇的生物合成需要以半胱氨酸形式存在的硫、亚铁状态的铁、由 NADPH 携带的电子，以及作为保护性还原力来源的谷胱甘肽（GSH）。因此，研究团队探究了 TIMM29 缺失情况下线粒体中半胱氨酸、铁、NADPH 和 GSH 水平的变化，以阐明 TIM22 复合体对铁硫簇生物合成的作用机制。研究团队通过离心法亚细胞分级分离或基于免疫纯化的快速线粒体分离方法（Mito-IP）富集线粒体，并通过 Agilent CG-MS 以及 Cytation 多功能微孔板检测系统测量线粒体组分中的代谢物丰度。结果显示，在平行对照实验中，半胱氨酸营养限制培养、敲除线粒体膜谷胱甘肽转运体 SLC25A39、或敲除线粒体 NAD 激酶 NADK2 后，线粒体中半胱氨酸、GSH 或 NADPH 的含量显著降低。而 TIMM 复合体组分 TIMM29 缺失后，线粒体中半胱氨酸、GSH 或 NADPH 水平几乎没有变化。这些结果表明：TIM22 复合体功能缺失并不会损害线粒体中半胱氨酸、GSH 或 NADPH 的合成代谢通路。通过线粒体靶向亚铁探针检测发现，TIMM29 表达缺陷的细胞中线粒体铁摄取能力降低。TIMM29 缺陷导致线粒体铁摄取减少，且当异种 TIMM29 被重新导入后，这一缺陷可被挽救。

图 4.（上）针对 HEK293T 中分离富集的线粒体，采用气相色谱 - 质谱联用技术（GC-MS）检测半胱氨酸水平；（中）采用酶偶联比色测定法检测谷胱甘肽（GSH）与还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的水平。（下）Fe2+ 摄入实验及 HEK293T 细胞生长曲线。样本包含 TIM22 复合体组分缺陷株及异源铁离子转运体回补株。

TIM22 复合体生物体体内功能：维持红细胞谱系细胞发育及骨骼肌生成

研究团队利用 CRISPR 技术构建 TIMM22 复合体组分 Timm29 基因敲除斑马鱼模型，发现突变体存在形态异常且胚胎期致死；其铁硫簇相关蛋白表达水平与对照组相比显著下降。胚胎受 精后 30 小时即出现血流无色、尾部造血组织红细胞减少等造血缺陷表型。此外，突变胚胎骨骼肌纤维线粒体易发生碎片化。异位表达稻米铁离子转运体 OsMIT 可恢复铁硫簇蛋白表达水平，进而挽救突变体的造血细胞谱系发育及骨骼肌发育缺陷。上述结果也证实“TIM22 - 线粒体铁摄取 - 铁硫簇合成” 调控轴的功能在脊椎动物中高度保守。

图 5. 在斑马鱼发育过程中，TIM22 复合体的核心功能是维持线粒体铁摄取，以保障铁硫簇的生物合成。

结论与展望

研究团队借助 CRISPR 报告基因筛选系统，筛选获得铁硫簇生物合成通路的候选调控因子 —— 线粒体载体转运酶复合体 TIM22，并体外细胞实验证实该复合体通过维持线粒体 Fe²⁺ 摄取促进铁硫簇合成，进而支撑细胞增殖；最后研究团队通过斑马鱼模型证实该复合体在体内具有维持红细胞谱系细胞发育及骨骼肌生成的功能。

在本研究中，Agilent CG-MS 气相质谱、Seahorse 能量代谢分析系统、Cytation 多功能微孔板检测仪及其他分析检测平台，助力研究团队交叉验证了 TIM22 复合体在线粒体铁硫簇合成中的关键调控作用，并确认了维持线粒体铁摄取这一调控机制，为 TIM22 相关遗传病的治疗提供了新线索及策略。

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