多色荧光标记原理 - 产品信息 - 相关知识

2025-01-10 17:02:33多色荧光标记原理: 多色荧光标记原理是指利用不同波长的荧光染料对同一细胞或组织中的多种生物分子进行标记，通过特定的荧光显微镜或成像系统观察并区分这些染料所发出的荧光信号，从而实现对多种生物分子的同时检测和定位。这种技术能够大大提高实验效率和准确性，广泛应用于生物学、医学等领域的研究中，如细胞分选、蛋白质相互作用分析、基因表达研究等。通过多色荧光标记，研究人员可以更深入地了解生物分子的功能和相互作用关系。

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多色荧光标记原理问答

2022-07-22 15:27:25荧光定量PCR实验，荧光标记怎么选？: 荧光定量PCR技术是将常规的PCR和荧光检测技术相结合，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，以此实现对初始模板的定量分析。荧光定量PCR技术作为当今生物学研究的重要手段之一，在基础科学、生物技术、医学研究、法医学、诊断学等多方面具有广泛的应用前景。说到荧光定量PCR技术，我们经常会问类似于“你的实验是染料法还是探针法”，“你用的探针是什么类型”等之类的问题，这其实是对荧光标记的选择。根据荧光标记的不同，可以将荧光定量PCR实验分为探针法和染料法两大类。染料法染料法利用能与DNA双链结合的染料来实现，如SYBR Green I。该染料在游离状态下呈现微弱的荧光，一旦与双链DNA的双螺旋小沟结合，其绿色荧光增强约1000倍。因此其总的荧光强度与双链DNA含量成正比，利用这一关系可以反映生成的PCR产物的量（图 1）。SYBR Green I的吸收约在497 nm，发射波长约在520 nm，与FAM荧光分子的光谱性质类似，因此在所有的荧光定量PCR设备中都是通道检测，即“FAM/SYBR Green I”通道。▲ 图1 染料法原理图理论上，所有能与双链DNA结合的染料都可以用于qPCR检测，如溴化乙锭EtBr，碘化丙啶PI，吖啶橙、Cy3等。而选择用于qPCR反应的染料通常会从信号强度、生物安全性、检测简便性和经济适用性这几个因素考虑。例如EtBr可能存在潜在的致癌性。综合考虑下来，SYBR Green I成了比较理想的选择。目前，使用Evagreen的实验者也越来越多，Evagreen作为一种新型的染料，其光谱性质与SYBR Green I类似，其优势在于：▶ 对PCR反应的抑制程度小。高浓度SYBR Green I会强烈抑制PCR反应，因此要控制其使用浓度，一定程度上降低了DNA检测的灵敏度。▶ 与DNA结合密度高。单位长度的DNA双链上Evagreen的密度更高，为饱和型染料，消除了SYBR Green I存在的“染料重分布”的缺陷，提高检测灵敏度的同时也可用于高分辨率溶解曲线HRM。▶ 化学性质更稳定，适合长期保存。TaqMan 探针TaqMan 探针基本可以满足60%以上的qPCR实验，如常规的基因表达和拷贝数变异CNV实验。TaqMan 荧光探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5'末端，而淬灭剂则在3'末端（图2）。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收; PCR扩增时, Tag酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。常用的荧光基团是FAM，TET，VIC，HEX。▲ 图2 Taqman探针MGB探针对于要分辨单碱基差异的SNP实验，采用对碱基错配容忍度更低的MGB探针，在淬灭基团后加入了DPI3基团（图3），从而提高了与靶标结合的亲和力；而且可以对靶点碱基进行化学修饰，如PeptideNucleic Acid和Locked Nucleic Acid。▲ 图3 MGB探针双杂交探针Taqman探针对探针的长度有比较严格的要求，双杂交探针则消除了这一“缺陷”。双杂交探针是由两条寡核苷酸单链组成，一条的3’端带有供体荧光分子，另一条的5’端带有受体荧光分子（图4）。游离状态下荧光供体会发出荧光，但当两条单链都匹配到模板链上时，就会发生荧光共振能量转移FRET，受体荧光分子就可以发出荧光，其荧光强度与生成的产物的量成正比。双杂交探针的优势有两点：摆脱了探针长度的限制，较长的探针可以提高与模板匹配的成功率；只有上下游两条探针都正确匹配后才能检测到受体荧光分子发出的荧光，特异性有所提高。▲ 图4 双杂交探针分子信标探针游离状态下，分子信标探针是一种茎环结构，其环状部分的15-30个碱基可以与靶标区域相结合匹配，下端的配对区域（左右一般各5-6个碱基）则由重复的GC组成，从而将5’的荧光分子和3’的淬灭基团紧紧聚在一起，荧光发生淬灭；当退火时，分子信标探针解开环并与模板靶标杂交，这样荧光分子和淬灭基团的物理距离就变大了，荧光淬灭的前提就打破了（图5）。除了MGB探针，分子信标探针也非常适合用于SNP检测。▲ 图5 分子信标探针除了上述几种类型的探针之外，还有尝试将引物和探针功能相结合的技术，如Amplifluor、LUX等，在设计难度上有所提高，但使用时更简便。各有其应用的侧重点和设计上的利弊，在此不多赘述。那么在荧光定量PCR实验中，我们应该如何进行选择呢？在这里，给大家总结了一些两种方法的区别，供大家参考。表1 染料法和探针法的区别

2022-12-30 11:24:37MICA实现Caspase 3/7多色检测: Caspases与细胞凋亡过程相关，因此可以利用caspase检测来确定细胞是否正在经历这种程序化的细胞死亡。这些检测可以通过例如流式细胞仪、平板读数仪实现，也可以在显微镜上完成，显微镜可为量化数据补充可见的结构信息。在这篇文章中，我们描述了MICA是如何用于caspase 3/7测定。借助Navigator或像素分类器等工具，MICA让设置、执行和分析caspase 3/7检测变得更加容易，即使没有经验的用户也可轻松操作。图像：双色caspase检测并进行拼接扫描。U2OS细胞用核标记物DRAQ5（品红）和CellEvent™（黄色）标记。加入4mM星形孢菌素以诱导细胞凋亡。20倍物镜下使用双通道荧光，持续16小时每30分钟获取一次2x2 FOV（视野范围）的扫描拼接图像。引言凋亡细胞检测或者活细胞/死细胞检测一般通过将某种物质应用于活细胞并观察细胞反应，以此检测其毒性或有效性。死亡率随时间推移而上升或者剂量依赖性上升均证明物质有效。判断潜在药物的抗癌效果便是一个典型示例。商用染料试剂盒可检测处于凋亡状态的细胞。这些试剂盒内染料为荧光染料，能够分别标记活细胞和死亡细胞。Caspase活性检测法是细胞凋亡检测法的一种。Caspase（半胱天冬酶）是参与细胞凋亡过程的一类半胱氨酸蛋白水解酶。它们还用于区分caspase介导的细胞凋亡或细胞坏死。这里的染料试剂盒使用的是DNA结合试剂，该试剂的荧光能够被四氨基酸肽(DEVD)阻断。一旦caspase-3和caspase-7（caspase-3/7）被激活，即当细胞处于凋亡状态时，caspase-3和caspase-7便会切割DEVD肽，然后DNA结合试剂便会开始呈现荧光。挑战由于添加剂浓度不同、孵育时间不同、染色类型或者细胞系等参数的不同，实验通常在多孔板上进行。这种方法有两个优点，一是能够在一个反应容器中设置多个不同的试验条件，二是只需要极少量的试剂和极低数量的细胞。但是，在实施过程中，用户仍然可能会被不同孔和不同实验的数量混淆。设置多孔板实验时，MICA自带的Navigator工具能够帮助预览。包括可以在虚拟画板上计划并设置每一孔的扫描拼接实验或者延时实验（见图1）。图1：导航工具。Navigator能提供整个样品载体的预览（例如，玻片、培养皿、孔板），并帮助用户设置实验。用户能够在整个孔板上操作导航并进入单孔内，比如界定感兴趣区域或者设计扫描拼接。追踪细胞活动需要使单一荧光通道的时空相关性成像。传统的宽场显微镜一般一次记录一个通道，因此每一个细胞结构只能按顺序、一个接一个地记录下来。这意味着两个不同的结构记录于两个不同的时间点。这对于极速发生的细胞事件来说可能会产生影响，特别是在共定位研究中。同时成像通过在同一时间记录全部荧光的方法规避了这一缺点。对于caspase活性检测法而言，这意味着用户能够观察到，例如在caspase-3/7被激活的瞬间线粒体的反应。MICA能够同时检测四种荧光，使用户可以同时观察到除细胞核、caspase-3/7活性、线粒体等之外的另一个细胞结构（见图5）。最后，如果想要确定某一特定试剂在诱导caspase介导细胞凋亡时的效果，则需要对caspase检测进行量化。这种量化需要通过专门的外部软件来实现。MICA自带分析解决方案，不需要另外的软件。通过MICA自带的像素分类器，用户能够标记一些感兴趣区域（ROI），人工智能算法可以训练和识别这些区域（见图2）。对于caspase活性检测法而言，细胞核信号可用于确定细胞总数。CellEvent™信号可用于识别caspase介导的凋亡细胞。图2：利用像素分类工具训练MICA识别图像中样品特征。通过在图像中标记示例特征，像素分类器能够训练和划分所有目标物。方法在这一案例研究中， U2OS细胞或者COS7细胞被铺在96孔板，然后培养一整晚的时间。在实验过程中，活细胞分别用DRAQ5、SPY-650-DNA以及TMRE孵育15分钟。之后，更换培养基，在实验结束前使用CellEvent™孵育细胞。每孔内加入凋亡诱导剂星形孢菌素（3 µM–7 µM）。在四色caspase活性检测法中，U2OS细胞被接种在96孔板上并在夜间生长，然后培养一整晚的时间。在实验过程中，活细胞与DAPI和TMRE孵育45分钟。之后，更换培养基，在实验结束前使用CellEvent™和SiR-Tubulin孵育细胞。每孔内加入凋亡诱导剂—星形孢菌素（3 µM–7 µM）。在37℃、5% CO2和~65%湿度的环境中，按照指示的时间间隔和持续时间用MICA进行活细胞成像。使用Navigator工具设定并执行检测。一些实验中会运行扫描拼接（参见视频2）。进行扫描拼接时，研究人员使用的主要策略是“focus Map”；此外，延时实验通过“Keep focus”来保持细胞的聚焦。使用MICA自带的分析功能进行本次实验中的数据分析。其中核心组件之一便是人工智能驱动的像素分类器，该功能位于“Learn”选项。通过像素分类器，用户能够标记其感兴趣区域（ROI），该区域将作为所有要检测的其他区域的示例。如图5所示，细胞核被像素分类器标记并检测。像素分类器同样能够标记并检测线粒体活性标识TMRE和caspase呈阳性的细胞。之后会在整个延时摄影过程中分析这批图像。经过计算之后，MICA会将计算结果以散点图、共定位图、直方图、饼状图、框图或者时间序列图的形式展示在“结果”选项中。图3：在分析过程中，MICA会标记作为样例的感兴趣区域，为人工智能驱动的分析功能提供信息。在此检测法中，细胞核（品红）和caspase阳性细胞（绿色）会被用于训练像素分类器，通过这种方式，像素处理器便有能力分析caspase介导的凋亡细胞比例。结果 SPY-650-DNA（标记细胞核）和CellEvent™（标记caspase 3/7活性）两种细胞染料的量化研究揭示了在活细胞实验中发生caspase介导的凋亡细胞。细胞核的数量说明了每张图像中细胞的数量，可与处于凋亡过程中细胞的数量相对应。另一个标记，即TMRE成像过程，揭示了线粒体活性。量化数据(如长度、宽度、面积)显示在采集图像下方的表格中，这些数据可被导出为Excel表格。获取的图像可以在延时成像的每一个时间点上查看，并可以与识别的ROI重叠。三色caspase 3/7活性检测图（图4）显示，细胞核信号在开始的时候增强，之后逐渐减弱。信号增强是因为核染色剂必须与DNA结合，这一结合过程需要一定的时间。另一方面，SPY-650-DNA信号减弱是因为细胞核解体，解体现象见相关图像。其他信号要么随时间增加而增强（CellEvent™），要么随时间增加而减弱（TMRE）：caspase介导的凋亡细胞数量增加的同时激活状态的线粒体数量减少。图4：三色caspase 3/7活性检测法量化研究。通过像素分类器检测细胞核、TMRE和caspase阳性细胞，以确定在不同浓度的星形孢菌素下，随着时间的推移发生caspase介导的凋亡的细胞数量。TMRE信号能反映线粒体的健康状态。结果可以多种形式展示，比如时间序列图。用户可以通过MICA一次性对四种荧光成像。在caspase 3/7活性检测法中，这有助于调查凋亡过程中额外的细胞成分的命运—实现100%时空相关性。图5中展示的案例显示，除了细胞核（DAPI）、激活状态的线粒体（TMRE）以及caspase阳性细胞（CellEvent™）以外，也对肌动蛋白细胞骨架（SiR-Actin）进行了染色。高倍率下（63x），用户能够看到，caspase被激活之后，肌动蛋白细胞骨架坍塌。与此同时细胞核以及线粒体停止工作。因为所有通道都是在一次拍摄中获得的，各细胞活动成像之间存在精确联系。图5：四色caspase-3/7检测，用SiR-Actin、TMRE（线粒体活性）、CellEvent™（caspase活性）以及DAPI（细胞核）标记U2OS细胞。在时间点0加入星形孢菌素。在63x高倍、宽场模式以及THUNDER（ICC）成像模式下获得的图像。结论Caspase活性检测法为研究抗癌药物提供了新的见解。为了实现这一目标，研究人员必须在保证高时空精准度的情况下将活细胞从凋亡细胞中区分出来。对于统计上可靠的结果，增加量很有必要。这就是为什么这类实验必须在孔板上进行，也必须进行量化研究。MICA满足以上全部要求。在FluoSync的帮助下，MICA可同时保证多达4种不同的荧光染料可以同时成像，不论是在单一培养皿上，还是在96孔板上。MICA完整的培养系统能够培育活细胞数日，同时其自带的基于人工智能的分析功能也有助于用户获得可靠的数据。参考：FluoSync - a Fast & Gentle Method for Unmixing Multicolour Images, Science Lab, Leica Microsystems (leica-microsystems.com)

2021-01-06 09:46:43多色荧光原位杂交技术(M-FISH)的基本原理及应用: 荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization，FISH)是根据核酸碱基互补配对原理，用半抗原标记DNA或者RNA探针与经过变性的单链核酸序列互补配对，通过带有荧光基团的抗体去识别半抗原进行检测，或者用荧光基团对探针进行直接标记并与目标序列结合，利用荧光显微镜直接观察目标序列在细胞核、染色体或切片组织中的分布情况。M-FISH则是在荧光原位杂交基础上发展起来的新技术，它不仅具有FISH的优点，而且克服了FISH的许多局限，其特点是可将多次繁琐的FISH实验和多种不同的基因定位在一次FISH实验中完成。M-FISH能同时检测多个基因，分辨复杂的染色体易位和微小缺失，区分间期细胞多倍体和超二倍体等。M-FISH用激发光谱和吸收光谱不同的荧光索按一定调色方法标记不同的探针，从而对不同靶DNA同时进行定位和分析，并能对不同探针在染色体上的位置进行排序。探针荧光素颜色调配的方法有非调色法，混合调色法和比例调色法。这3种调色法中，比例调色法只需要几种荧光素就可标记多种探针，因而更有发展潜力。染色体描绘、比较基因组杂交、光谱染色体自动核型分析、交叉核素色带分析及多彩色原位启动标记等技术都是在M-FISH的基础上发展起来的。与其他原位杂交技术相比，多色荧光原位杂交具有很多优点，主要体现在：①宜于多靶杂交，可对同一个细胞学制片进行多个探针杂交；②通过在同一个核中显示不同的颜色可一次性显示全部的染色体数量或结构的变化；③能检测到传统显带方法不易发现的亚纤维染色体畸变不仅能够鉴定隐藏的易位和复杂的重拍，而且可以分析与肿瘤发生相关的重要标记染色体及其基因。目前该项技术目前已广泛应用于动植物基因组结构研究，染色体精细结构变异分析，病毒感染分析，微生态分析，肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。明美MFISH荧光原位杂交分析系统就是一款专为荧光显微图像的捕捉和处理而开发的实用图像软件。它搭配不同波段光谱滤光片的荧光显微镜以及高灵敏度的相机可对多种探针信号进行检测成像，还有区域自动曝光，自动着色，信号点增强，一键合成多色荧光通道图像，自定义各种颜色的探针，多焦面信号景深叠加，多层图像位置偏移较正等功能。深圳禾正医院的老师采用了明美的MFISH荧光原位杂交分析系统，检测中用her2/cep17的比值来测定是否有此原癌基因扩增，当HER2／CEP17比值≥2.0时，为HER2阳性；此外老师还定制了双通道荧光模块，可以同时在目镜下观察到红绿两种颜色的信号点，大大提高科室的工作效率。（来源：http://www.mshot.com/article/903.html 广州市明美光电技术有限公司）

2021-12-23 10:16:13遇见“Prima”——德国PicoQuant全新推出多色激光器: 近日，在德国柏林最近的一次网络研讨会上，PicoQuant向大家展示了其最新的激光创新良心之作：独立的、全电脑控制的激光模块Prima。 PicoQuant公司的产品经理Guillaume Delpont阐述了这款激光器的设计初衷：“许多科研人员在工作中都面临着同样的困难，那就是他们需要多个激发波长来研究他们的待测样品，而购买多个激光器又会变得非常昂贵。PicoQuant公司为了给科研人员面临的共同挑战提供解决方案，最终依托自身在激光开发方面长达25年的专业背景和研发实力，创造了Prima—— 一种经济实惠、紧凑的激光模块，可以发出红色、绿色和蓝色的脉冲激光。” Prima—三色皮秒脉冲激光器Prima是一款独立、紧凑、价格合理的激光模块，提供3个独立的发射波长，可以在皮秒脉冲和连续波(CW)模式下工作。皮秒脉冲可以由Prima模块的内部时钟触发，也支持高达200MHz的外部触发。该模块采用全电脑控制，操作非常简单：通过USB端口将Prima连接到PC端，所有操作参数的更改都可以通过一个方便的软件接口完成。红、绿、蓝：三种最有用的波长Prima可以提供三种波长的激光：640nm、515nm和450 nm。每种颜色都可以单独输出，每次输出一个波长。这三种颜色是材料科学、化学和生命科学中最常用的3种波长，广泛应用于光谱学或显微镜应用的常规激发，进行种类多样待测样品的研究，其中包括新型纳米材料、量子点、分子和荧光团。 Prima是一款几近完美的工具：当涉及到日常实验室任务时，能够满足您的大多数需求，如寿命或量子产率测量，光致发光和荧光测量等。灵活多样的工作模式：脉冲、连续和快速开关模式在进行时间分辨或稳态测量的时候，无论您需要哪种类型的操作模式，Prima的灵活性都可以轻松实现。Prima同时也支持快速连续开关功能。脉冲模式支持内触发和外触发，内触发的重频率范围从100 Hz至200 MHz可调，外触发支持的重复频率范围从单次脉冲至200 MHz。每个波长的平均输出功率高达5mW。在CW工作模式下，每个波长可以达到更高的平均输出功率(高达50 mW)。在CW工作模式下，进行ON和OFF状态切换的上升/下降时间小于3 ns。恒定的重复频率可以通过内部触发来进行设置，Burst工作模式也可以由合适的外部触发源实现触发(例如，PicoQuant的Sepia PDL 828的振荡器模块)。您甚至可以将Prima与其他激光模块组合使用，从而实现更为复杂的激发模式，不仅包括Burst模式，还包括脉冲交替激发(PIE)或交替激光激发(ALEX)。这使得Prima成为一个通用的工具，可以在许多环境中使用。易于使用作为一个独立的激光模块，Prima不需要任何其他外部激光驱动对齐进行控制。其参数设置和操作通过一个基于成熟的Sepia的图形用户界面软件进行全电脑控制。

2023-05-08 19:13:14明美LED荧光光源助力显微镜荧光升级: 明美LED荧光光源助力显微镜荧光升级荧光显微镜具有特异性强、检出率高等优势，因此在各种科研和医学检查应用中使用广泛，传统荧光显微镜因为汞灯光源限制，有比较多使用难点，明美针对这些问题，投入大量人力和资金，研发出了一系列LED荧光光源，助力显微镜荧光升级和传统荧光显微镜升级LED荧光显微镜，取得市场广泛认可。荧光显微镜的常用光源通常都是白光光源，而荧光光源有高压汞灯，氙灯，金属卤素灯和LED白光光源以及LED单波长光源，光源间各有优劣势，近期，北京用户需要替换汞灯光源，因为汞灯寿命短，需预热，操作繁琐，明美北京区域工程师提供了四通道的LED荧光光源MG-120，寿命长，即开即关，操作简单，解决的老师的使用烦恼荧光光源MG-120采用四通道独立控制，可选BGUR等不同通道配置，寿命长，衰减慢，通常不需要更换灯泡及校准，可以即开即用；控制方便，外部配备有控制器，能进行特定波长开关和亮度记忆，减少荧光串色及荧光淬灭。此次，用户是搭配奥林巴斯倒置显微镜IX73，该荧光光源已做测试，可适配各荧光显微镜如果您对荧光光源感兴趣或存在疑问，欢迎与我们联系，我们将竭诚为您服务！来源：https://www.mshot.com/article/1738.html