X-Gluc--转基因植物常用GUS显色底物

Gus基因（β-glucuronidase，β-D-葡萄糖苷酸酶）是从大肠杆菌中分离出来的，其编码的β-葡萄糖苷酸酶是一种水解酶，能催化许多β-葡萄糖苷酯类物质的水解。绝大多数植物细胞内是不存在内源的GUS活性，因此Gus基因广泛用作转基因植物的报告基因，尤其广泛应用于研究外源基因瞬时表达的转化实验。此外，Gus基因3’端与其他结构形式的融合基因也能够正常表达，所产生的融合蛋白仍具有GUS活性，这对研究外源基因表达的具体细胞部位提供了方便条件，也是它相对于其他报告基因的一个优点。

图1 X-Gluc分子结构式(CAS NO.114162-64-0)
 

X-Gluc(5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronide)可作为GUS的显色底物。在适宜条件下，GUS可催化底物X-Gluc分解，反应分为两步：首先是切割葡糖醛酸部分产生无色吲哚氧基中间产物，随后吲哚氧基中间产物被氧化成蓝色不溶5,5’-二溴-4,4’-二氯，借此用来观察转基因植物中外源基因的表达情况，鉴定转基因植株。

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GUS活性检测（组织化学染色）
 

1、配制X-Gluc储存液(20 mg/mL)

用1.5 mL DMF溶解30 mg X-Gluc粉末，终浓度为20 mg/mL。涡旋混匀，用铝箔包好，分装，于-20℃储存，一年内有效（注：若失效后，溶液则会变成亮红色）。

2、取材

将叶片、花瓣、根茎等组织剪成小片，放于1.5 mL离心管中于4%多聚甲醛（新鲜配置）固定30 min，然后用磷酸盐溶液或柠檬酸盐溶液润洗。

注：用于染色的植物材料的制备方法要因涉及的特定组织和器官的不同而异。例如，拟南芥的根、花和叶片以及烟草幼苗的根就可以不作任何预处理而直接染色。但是像烟草和马铃薯这些植物的茎和叶就必须在染色前切成薄片(1-3mm)。当操作大的组织和样品时，可以选用真空渗入法来帮助底物渗入细胞。

3、染色

加入稀释后配制好的GUS染色工作液(1 mg/mL)至完全覆盖材料，25-37°C孵育1h至过夜，有明显蓝色出现。注意要做阴性和阳性对照实验。

4、洗脱

将材料转入70%乙醇或80%丙酮中脱色2-3次，至阴性对照材料为白色。GUS染色阳性的蓝色斑点很稳定，在酒精中不褪色。

5、观察

一般染色后，GUS染色阳性的蓝色斑点肉眼就能看到。但是有些材料可能蓝色斑点很细微，要在显微镜下才能看到。
 

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