单细胞分选器测序的样本操作原则和注意事项

       单细胞分选器是一种用于生物学、农学领域的分析仪器。单细胞分选器可以在显微镜直接观察下，根据细胞形态学，荧光标记或位置，从贴 壁，悬浮和三维细胞培养系统，快速精确采集感兴趣的单细胞或细胞团。本仪器可 以在实验室常规使用的细胞培养器皿上直接采集细胞。

       1、单细胞分选器测序的样本要求

（1）样品总量：细胞悬浮液，欧易上门提取一个样本细胞起始量大于 1×10  5 个；

（2）样品浓度：5×10  5  - 1.2×10  6  / mL，Z 低需要 1×10 5  / mL；

（3）细胞活性：活细胞数在 90 %以上；

（4）细胞大小：小于 40 µm；

（5）细胞培养基及缓冲液不能含有 Ca  2+ 和 Mg  2+ 等影响酶活性的物质；

（6）组织需解离成单细胞悬液，植物细胞需制成原生质体。

       2、单细胞分选器测序的样本准备原则

（1）建议使用宽枪头重悬，以减少对细胞的损伤；

（2）每次移液前先混匀细胞悬液，然后从管中部吸取；

（3）所有环节都Z 好在无菌环节下操作、使用无核酸酶的试剂、减少移液步骤以及当可能损伤细胞的时候尽量使用宽枪头等。此外，可用一次性转液管去除离心后的上清液，以减少细胞沉淀的干扰；

（4）取样的时候Z 好设置两个重复，对每个样品计数 2 次，即共计 4 次计数；

（5）弃上清时候注意不要破坏细胞沉淀；

（6）某些细胞如 hPBMCs 在 PBS 中易成团状，从而降低细胞有效浓度，因此制备细胞悬液需迅速，Z 好在 30 分钟内完成；

（7）Z 佳上样体积为 2.5 µL-15 µL，建议上样前根据实际需要上样细胞数调整单细胞悬液浓度；

（8）对于直径较大的细胞如永生化细胞株建议室温下 150 rcf 离心 3 min，对于直径较小的细胞如PBMCs 建议室温下 300 rcf 离心 5 min；

（9）重悬细胞浓度建议不要超过 5000 cells/ µL，Z理想的范围保持在 700-1200cells/ µL，此浓度下计数较为准确；

（10）一般选用含 0.04% BSA（400µg/ mL）的 1× PBS 溶液重悬细胞。但 PBS并不适用于所有细胞，如原代细胞、干细胞等敏感细胞类型可能需要另换缓冲液以Z 大 程 度保证活性，已确定以下溶液对人293T/17 和小鼠 NIH/3T3 细胞系的10 ×单细胞操作无影响：

a. Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline（DPBS）；

b. Hank’s Balanced Salt Solution（HBSS）。

若在上述缓冲液中无法保证活性，可以选用细胞培养基洗涤细胞，以下培养基已确定对人 293T/17 和小鼠 NIH/3T3 细胞系的 10×单细胞操作无影响：

Eagle’s Minimum Essential Medium（EMEM）+ 10% FBS；

Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM）+ 10% FBS；

Iscove’s Modified Eagle Medium（IMEM） + 10% FBS；

Roswell Park Memorial Institute（RPMI）+ 10% FBS；

Ham’s F12 + 10% FBS；

1:1 DMEM /F12 +10% FBS；

M199。