深蓝云qPCR知识小课堂---SYBR Green染料法

TaqMan探针法因其良好的特异性以及可多重检测而受到实验人员的青睐，其实除了探针法外，还有很多好的实验方法也被实验人员广泛认可，这次就介绍一下另一个应用广泛的方法：SYBR Green染料法，它又是因为哪些优点获得实验人员的青睐呢？

染料法原理

染料法一般使用的是SYBR Green I染料，这是一种可以与双链DNA小沟结合的荧光染料，其不会与单链DNA结合，且在游离状态下几乎无荧光，只有与双链DNA结合才会发出荧光，因此将PCR扩增产生的双链DNA数量与荧光强度直接关联，产生实时监测的效果。

SYBR Green染料法优点

☑  通用性好，适合进行大多数类型的定量反应，可以进行熔解曲线的分析。

☑  无需设计探针，引物设计相对简单，不用考虑基团选择，易于上手；成本低，无需合成探针。

☑  无需PCR后处理，减少分析工作量并节省材料成本。

SYBR Green染料法缺点

SYBR Green染料法也有其缺点，SYBR Green染料法一个反应只能检测一个基因，无法进行二重甚至多重的实验。同样的相对于TaqMan探针法其特异性较差，当引物存在二聚体或者非特异性扩增时，染料同样可以结合并发出荧光，影响定量结果。因此对于SYBR Green染料法而言，设计一套好用的引物是重中之重。

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设计好引物后，我们该怎么进行实验呢？

1.实验条件的优化

我们需要对设计的引物扩增效果进行分析，使用阳性模板进行扩增，确定扩增产物为单一条带，且大小符合设计预期，如有条件可以对扩增产物进行测序，保证准确性。当引物无问题后，进行反应条件的探索，对退火温度进行温度梯度检测，找到合适的退火温度，即PCR扩增效果好，阴性模板无扩增，条带单一，熔解曲线单峰等。

2.预实验

设计好引物并探索好实验条件后，对样本进行一次预实验，预实验将样本进行梯度稀释用以制作标准曲线，分析内参基因以及目的基因的扩增效率是否接近且在100%左右，其次可确认高浓度模板中是否有yizhi剂干扰，从而确定实验时合适的模板浓度（样本是否需要稀释或浓缩）。

3.正式实验

当我们完成了实验条件和预实验后就可以进行正式实验了，每个样品都需要3个或以上的重复，保证结果的准确性。

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