BIO-GENER
在聊qPCR之前依旧是得先聊一下基因学之父：沃森和克里克。
1953年4月25日，沃森和克里克在Nature杂质上发表了题为“核酸的分子结构”的论文，揭示了DNA分子的双螺旋结构，也因此共同获得了1962年的诺贝尔生理学或医学奖。
在这篇论文里摘两点出来：
双螺旋结构：DNA是由两条反向平行的多核苷酸链组成，糖和磷酸骨架在外，碱基在内，两条多核苷酸链靠碱基之间的氢键结合在一起，整体呈螺旋状。
碱基互补配对原则：DNA一条多核苷酸链上的A，总是与另一条多核苷酸链上的T形成氢键;而G总是与C形成氢键。
理科的朋友们是不是对此图很是熟悉
再聊qPCR技术，目前已是分子生物学研究中一极为常见的检测手段，简单概括为在PCR反应的过程中通过在退火延伸阶段收集荧光信号，实时的检测PCR反应的技术。荧光信号的来源可以是SYBR Green为代表的染料，也可以是标记了荧光基团和淬灭基团的水解探针。SYBR Green染料本身在497nm波长的光刺激下仅发出微弱的荧光，但与双链DNA结合后，发射的荧光大大增强，发射波长约为520nm（对应上文的论点1，发光是基于DNA结构的特异性）。水解探针的荧光基团和淬灭基团在探针结构完整时，在激发光的照射下不发出发射光（发射光被淬灭基团吸收）；探针被水解后（基于碱基互补配对原则，探针结合在经变性的DNA单链上，在后续的扩增过程中被Taq酶的外切活性切断，荧光基团与淬灭基团分离）荧光基团再经激发光照射就可发出发射光（对应论点2，发光基于DNA碱基序列的特异性）。不论染料法还是水解探针法，每经过一个循环后信号积累的理论相对量都是一样的，都是上一个循环的2倍（基于半保留复制的机理）。
qPCR反应的前期因为产物量很少，所以积累的荧光有限，不足以被仪器分辨出是否是本底的荧光信号。当随着反应的进行，荧光信号逐渐积累，荧光信号积累至可与本底信号进行明显的区分时，此时的荧光强度（纵坐标数值）则称为阈值，通过阈值的水平横线为阈值线；扩增曲线和阈值线交点的横坐标所代表的生物学意义是，初始样本历经多少个循环反应后的荧光（产物）积累达到仪器能明确区分的水平（Ct值or Cq值，通过数值的大小衡量初始模板的多寡）。
qPCR循环段反应，从开始到Ct值，产物信号的积累近似于以每经历一个循环，信号扩大2倍进行，这是定量法计算初始浓度的理论基础，虽然在实际的检测过程中无法被检测到。原因是前期（基线期）本底信号强，掩盖了初始产物信号积累的变化，仪器能明确区分本底信号与产物信号是在经历过Ct值以后。经过Ct值之后，随着引物、dNTP的被消耗，信号扩大会在极短的时间内（指数期）进入以不足2倍的速率扩增的区间（线性期）。随着反应的继续，引物被近乎耗尽、酶活力降低、反应副产物积累等因素影响qPCR反应近乎停止，产物基本不在增加，荧光信号的强度也基本维持在一定值（平台期），如下图：
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