【柏恒科技小课堂】qPCR反应漫谈（续）

首先，DNA成为单链是引物可以顺利结合的前提，如果没有经过充分的解旋，扩增效率肯定会大受影响（等温扩增不在此列）。比如扩增cDNA变性大概10sec就够，扩增质粒则往往要30sec及以上。

其次，荧光探针需要先于引物结合到模板上，不论是水解探针还是蝎形探针。否则就会出现变性好的单链DNA在引物和酶的作用下都已经补齐了另一条链了，探针还在一边傻傻的说：“我没上车啊~”

最后，常规的qPCR扩增片段一般在200bp左右，延伸时间设定30-45sec也基本够用。至于说延伸温度，多会把退火和延伸合并为一步，温度采用60℃。但是有些反应，因为整体的反应优化不太理想或者是反应自身的一些固有限制，两步法扩增的效果不够好，此时可以使用三步法扩增，提高产物积累。采用三步法扩增时有个值得推敲的点，信号收集该是在退火阶段还是延伸阶段？染料法、水解探针、蝎形探针的答案并不完全一样，可自行推导一番然后理论联系实际验证一下。