PCR的反应流程

PCR是聚合酶链式反应的简称，是一种酶促化学反应，可以在试管里将待测的目的基因在很短的时间内扩增五十万倍乃至上百万倍，大大提高了基因诊断的灵敏度，降低了分析的难度。PCR法是目前基因诊断中使用Z多的方法。下面就让小编带你了解一下PCR的反应流程。

PCR反应流程

1.温度与时间的设置

对变性-退火-延伸三个温度点进行设置。在标准反应中，采用三温度点法，当温度为90-95摄氏度时，双链DNA变性，再将温度迅速降低到40-60摄氏度退火，Z后将温度提升到70-75摄氏度延伸。对于长度为100-300bp的短靶基因，可以采用二温度点法，就是将退火和延伸的温度合二为一，通常在94摄氏度变性，在65摄氏度左右退火和延伸。

（1）变性温度和时间

变性的温度通常为93-94摄氏度，使模板变性的时间1分钟足够，如果温度小于93摄氏度，那么需要适当延长时间。然而温度不能够过高，否则会影响酶的活性。

（2）退火温度与时间

退火温度会对PCR特异性产生重大的影响。靶基因序列的长度、碱基组成和浓度以及引物的长度决定了退火的温度和时间。

在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可以使得引物和模板间的非特异性结合大大减少，从而使得PCR反应的特异性提高。

（3）延伸温度与时间

延伸的温度通常在70-75摄氏度之间选择。72摄氏度为延伸常用的温度，如果延伸的温度过高，那么会对引物和模板的结合不理。延伸的反应时间取决于待扩增片段的长度。如果DNA片段的长度在1kb以内，那么延伸时间1分钟足够。如果靶序列的长度为3-4kb，延伸时间需要3-4分钟，如果扩增10kb的长度，那么延伸时间需要到15分钟。如果延伸时间过长的话，会引起非特异性扩增，如果扩增的模板浓度低，那么需要适当延长延伸时间。

2.循环次数

循环的次数决定了PCR的扩增程度，循环的次数主要由模板DNA的浓度决定。循环的次数一般选在30次左右，循环的次数越多，非特异性产物的量也随之增加。

PCR产物检测

琼脂糖凝胶电泳（Z常用）、PCR扩增产物的直接测序、限制性内切酶酶切分析、分子杂交、层析技术：GX液相色谱（HPLC）和离子交换层析（IEC）以及聚丙烯酰胺凝胶电泳。