【柏恒科技小课堂】PCR反应的过程控制

PCR是分子生物学研究的基础实验之一，常做实验的同学或许认为非常简单，但对新人来说其实并不是那么友好。今天小编来分享下曾经踩过的那些坑（血泪史）……

首先，优质的模板是成功反应的前提。优质的模板需满足以下几点：高纯度、足够的长度、适宜的浓度。核酸纯度可以用超微量分光光度计检测的两个比值来衡量（260/280和260/230）。当然超微量也可以检测核酸的浓度，但不能有效反应核酸的长度。常见的动物血液、组织、或者植物组织用超微量分光光度计检测浓度没有问题，但石蜡包埋样本或者石蜡切片样本检测就需慎重，使用超微量分光光度计检测纯度的同时需要辅助其他手段验证其浓度是否准确，比如跑胶看一下是否有明亮光影区（包埋样本提取的核酸在所需长度附近有明亮的片状光影就OK了，基本没有条带一说）或者用染料法（Qubit）复测一下。最后再说一下适宜的浓度，扩增试剂说明书中规定模板添加体积的同时大多也会说明投入核酸的总量，这时就需要根据核酸的浓度进行简单的计算，不足的体积用水补足，投入反应的核酸过多反而会导致非特异产物的增加。如果提取的核酸浓度过低，就只能适当的扩大添加体积，不过要适量，扩大反应体积的同时也意味着dNTPs、酶、引物等浓度的下降，进而影响扩增体系的性能。

其次，搭配合理的反应体系是成功反应的保障。PCR反应的五要素，除了模板其余四项都能归入反应体系的范畴。常规的PCR实验中，引物的浓度相对固定，所以只要找市场上口碑不差的合成公司来合成基本不会有什么问题。需要注意的是，引物如果溶了应立即分装冻存，最小分装量根据每次实验所需体积自行确定。切忌引物溶解后不进行分装，整管冻存，反复冻融个三五次后效果就会下降不少。镁离子、DNA聚合酶、dNTPs三者的相关性较高。dNTPs会结合镁离子，被结合的镁离子就无法再和DNA聚合酶结合，无法激活DNA聚合酶的活性。所以镁离子的摩尔浓度一定要大于dNTPs的总浓度，但过高浓度的镁离子在提高酶活和产物量的同时也提高了PCR反应的错配率。所以如果PCR反应结束后需要对产物进行测序研究就不推荐较高的镁离子浓度。dNTPs也是类似，较高浓度有助于获得更多的扩增产物，但也会提高反应的错配率。至于聚合酶，现在市场化的商品更青睐于混酶（高保真酶和Taq酶混合）既兼顾扩增反应的保真又保证了最终产物的得率。概括下来，PCR的反应产物若是需要进行测序研究就推荐相对低浓度镁离子、dNTPs的反应体系，让碱基序列高度保真；若是仅看扩增曲线或者产物条带的话就推荐较高浓度的镁离子、dNTPs的反应体系，保证有更多/高的产物、信号。注：PCR反应本身存在极低的错配率，对于分析产物的条带大小或者qPCR的荧光信号分析不会有影响。但若进行测序分析就需要考虑将错配率降至不影响测序结果的水平。

最后，相匹配的反应程序是成功反应的桥梁。模板在一次次的升降温循环中完成自身的复制过程。常见的95℃变性、55℃退火、72℃延伸适用于大多数反应，可以得到所需的目标产物。但具体到某一实验时，还需根据引物的Tm值对反应的温度进行微调，降低非特异扩增、增加目标产物，以期达到最佳的反应效果。

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