【柏恒科技小课堂】浅谈PCR扩增体系

首先是PCR反应缓冲液，标准缓冲液含：50mM KCl，10mM Tris-HCl，1.5mM MgCl2。其中Mg2+的浓度对反应的特异性及产量有着显著影响。浓度过高，使反应特异性降低；浓度过低，使产物减少。在各种单核苷酸浓度为200μM时，Mg2+为1.5mM 较合适。然而Mg2+会与体系中的其他物质如EDTA、dNTP等反应从而使部分Mg2+不能和酶结合。据经验，一般以1.5-2mM（终浓度）较好。

其次是dNTP，dNTP是合成DNA的原材料高浓度dNTP易产生错误掺入，过高则可能不扩增；但浓度过低，将降低反应产物的产量。PCR中常用终浓度为50-400μM的dNTP。四种脱氧三磷酸核苷酸的浓度应相同，如果其中任何一种的浓度明显不同于其它几种时（偏高或偏低），就会诱发聚合酶的错误掺入作用，降低合成速度，过早终止延伸反应。此外，dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。在有的反应体系中会会对dNTP进行修饰以达到特殊实验需求。

PCR体系中的核心是DNA聚合酶，其中的经典是Taq DNA聚合酶。在100μl反应体系中，一般加入2-4U的酶量，足以达到每分钟延伸1000-4000个核苷酸的掺入速度。酶量过多将导致产生非特异性产物。但是不同的公司或不同批次的产品常有很大的差异，由于酶的浓度对PCR反应影响极大，因此应当作预试验。随着PCR技术的发展，各种功能和特点的DNA聚合酶越来越丰富，比如高保真DNA聚合酶，高特异性DNA聚合酶，快速DNA聚合酶等。

引物是引物是决定PCR结果的关键，引物设计在PCR反应中极为重要。要保证PCR反应能准确、特异、有效地对模板DNA进行扩增，通常引物设计要遵循以下几条原则：

引物的长度以15-30bp为宜，一般（G+C）的含量在 45-55%，Tm 值高于55℃［Tm=4(G+C)+2(A+T)］。应尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列，碱基的分布应表现出是随机的。

引物的 3’端不应与引物内部有互补，避免引物内部形成二级结构。

人工合成的寡聚核苷酸引物需经PAGE或离子交换 HPLC 进行纯化。

引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端：一是容易形成引物二聚体（primer-dimer），二是当扩增微量靶序列并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异性产物。

引物一般用TE配制成较高浓度的母液（约100μM），保存于-20℃。使用前取出其中一部分用ddH2O配制成10μM或20μM的工作液。

PCR对模板的要求不高，单、双链DNA均可作为PCR的样品。虽然PCR可以用极微量的摸板进行扩增，但为了确保反应的特异性，一般用μg水平的基因组DNA作为起始材料。但要注意的是模板的提取过程中可能会混有蛋白酶、核酸酶、DNA 聚合酶抑制剂以及其他影响酶活性的化学试剂，将干扰PCR反应，影响扩增结果。 

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