【柏恒科技小课堂】PCR实操避坑分享

先说体系配置（各组分分开，非预混液）。配置前先计算好所需要的各组分体积，统一配置好后再进行分装。有的同学可能会心疼试剂，独爱单孔配置方式……但对于实验来说，一次即可顺利获取有效结果才是最大的节约。在体系的配置时需注意一下各组分的添加顺序：先加ddH2O,其余组分再按体积大小依次加入。排液时，吸头扎入液面以下排液，排出液体后严禁原处反复吸打润洗枪头（引物、酶、模板尤其需要注意）。吸头有一定的吸附性，液体被排出后，如在原处润洗组分会被反吸回吸头，经过三五次的润洗可能会使目标组分有严重的损失。如果想将吸头内的组分充分转移，换个位置去润洗吸头。体系混匀也需注意，可以用合适量程的移液器缓慢吹打5-10次，也可以缓慢上下颠倒混匀；如果需要用涡旋振荡器混匀的话，转速尽量控制在600rpm以下，转速过快的话对酶的损伤较大，低拷贝模板的曲线是否起跳差异会比较明显。体系分装到pcr反应管时，移液器保持“吸一打一”的操作，不易生成气泡。

再说实验环境。老生常谈的要在超净工作台内配置反应体系，生物安全柜内添加模板。超净台内，按照常规操作不会有太大问题；生物安全柜可是气溶胶污染的重灾区。生物安全柜内气溶胶主要来源于加样后的弃吸头，生物安全柜内以循环风为主，弃吸头内的残留模板很容易会随循环风弥漫整个安全柜的内环境，所以每次实验完都需要及时把弃吸头打包好取出安全柜。尤其遇到中午没有完成整个实验下午还要继续爆肝的情况，一定要把垃圾桶内的弃枪头清理干净，如果没有人使用的话就擦拭后进行紫外照射。实验结束后的台面清理及紫外消杀均属基操，但需切实落实到位。

最后分享一下复孔实验如何操作可以提高曲线的成束性。配置反应复孔时，可以参照统一配置体系的操作，将所有反应孔的模板和体系混和好再逐孔分装。这样可以有效降低跳孔的风险。如果是低拷贝扩增（Ct值33以后曲线起跳），就不推荐模板混入反应体系再分装了，此时还是老老实实的逐孔加入模板更为稳妥（泊松分布影响明显）。