【柏恒科技小课堂】怎么理解QPCR “定性/定量”和“相对定量”

BIO-GENER

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（一）定义

绝对定量直接测量目标分子拷贝数，不依赖参照基因表达水平，通过构建标准曲线确定样本中目标分子绝对数量，适用于需知确切分子表达的情况。

（二）实验设计

标准曲线制作：准备与目标分子大小和GC含量相似的 核酸序列作标准品，进行系列稀释，对各稀释度标准品进行qPCR反应并记录Ct值，以浓度对数为横坐标、Ct值为纵坐标绘制标准曲线，确保线性良好、R2值接近1。

实验操作步骤：从组织等提取DNA/RNA，配置含DNA/RNA模板等的反应体系，在qPCR仪器上反应并记录目标基因和标准品Ct值，用标准曲线计算样本中目标分子绝对拷贝数。

（三）应用场景

病毒载量测定：在病毒感染研究中，绝对定量可直接测量病毒基因拷贝数估算病毒载量。

基因拷贝数变异分析：在遗传学研究中，绝对定量能精确测量特定基因拷贝数，助研究人员识别与疾病相关的基因拷贝数变异。

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（一）定义

相对定量通过比较目标基因与参照基因表达水平定量，无需知道目标分子绝对拷贝数，用内参基因标准化目标基因表达量以消除实验变异，广泛用于基因表达分析。 特别是在比较不同样本或不同条件下基因表达变化的研究中。

（二）相对定量的实验设计

内参基因的选择：选择合适内参基因是相对定量成功关键，其应在所有样本中稳定表达，不受实验条件影响。选择标准为稳定性（表达在不同样本和条件下保持稳定）、相似的表达水平（与目标基因相似以减少定量误差）、无干扰（不应与目标基因存在交叉反应）。常用内参基因有管家基因，如β - actin、GAPDH等，在大多数细胞类型中表达稳定。

ΔΔCT方法：是常用相对定量分析方法，通过比较目标基因和内参基因的Ct值计算相对表达量。

计算过程为：先计算ΔCT（目标基因Ct值与内参基因Ct值之差），再选一个样本作对照组，计算其他样本与对照组的ΔCT差值得ΔΔCT，最后用2^ - ΔΔCT公式计算相对表达量。

（三）相对定量的应用场景

基因表达分析：相对定量可助研究人员了解特定基因在不同条件下的表达变化。操作步骤包括样本收集、RNA提取、cDNA合成、qPCR反应、数据分析（用ΔΔCT方法）。

条件变化下的表达差异分析：相对定量在比较不同条件下基因表达差异中很重要，如药物处理、疾病状态等。应用示例有评估药物分子作用机制（比较药物处理前后基因表达变化）、寻找潜在生物标志物（分析疾病与正常状态下基因表达差异）。

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（一）优缺点比较

绝对定量优点：精确性高，能提供目标分子精确拷贝数，适用于需具体数值的研究；直接测量，不依赖内参基因，减少因内参选择不当带来的误差。

缺点：操作复杂，需制备和分析标准曲线，增加实验复杂性和时间成本；成本较高，标准品制备需额外成本和时间。

相对定量优点：操作简便，不需要制备标准曲线。 优点：简单，可通过选合适内参基因适应不同实验条件。

缺点：依赖内参基因，结果准确性取决于其稳定性，表达不稳定会影响结果；相对测量可能因内参选择不当引入误差。

（二）选择依据

实验目的：需知目标基因确切拷贝数（如病毒载量测定、基因拷贝数变异分析）选绝对定量；比较不同样本或条件下基因表达变化（如基因表达分析、条件变化下表达差异分析）选相对定量。

样本类型和数量：稀有或珍贵样本，绝对定量更合适，能提供更精确测量；处理大量样本，相对定量更高效，可简化实验流程。

（三）最佳实践建议

实验设计建议：制备标准曲线用与样本来源相似标准品提高定量准确性；选在实验条件下表达稳定、无显著变化的内参基因；至少进行三次重复实验确保结果可靠、可重复。

数据分析建议：相对定量中对数据适当归一化处理减少技术变异影响；解释结果时考虑实验设计、样本处理和数据分析各步可能引入的变异；用专业数据分析软件提高分析准确性和效率。

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