PCR的反应特点
PCR技术是模拟体内DNA的天然复制过程,在体外扩增DNA分子的一种分子生物学技术,主要用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物,经变性、退火和延伸若干个循环后,DNA扩增2倍。
反应特点
纯度要求低
不需要对病毒或细菌进行分离以及培养,扩增模板可以使用DNA 粗制品及RNA。临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等可以直接用来DNA扩增检测。
简便、快速
耐高温的Taq DNA聚合酶在PCR反应中被使用,一次性加好反应液后也就是在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应。完成扩增反应通常需要2~4 小时。扩增产物通常使用电泳分析,不一定要用同位素,没有放射性污染,容易推广。
灵敏度高
PCR产物的生成量呈指数级增长,起始待测模板可以从皮克(pg=10-12)的量级扩增到微克(μg=-6)的水平。在对病毒的检测中,PCR的灵敏度能够达到3个RFU(空斑形成单位)。在细菌学中Z小检出率为3个细菌。可以从100万个细胞中检出一个靶细胞。
特异性强
PCR反应的特异性决定因素为:
①靶基因的特异性与保守性。
②Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性。
③碱基配对原则。
④引物与模板DNA特异正确的结合。
其中,决定PCR反应的特异性的关键是引物与模板的正确结合。引物链的延伸以及引物与模板的结合均遵循碱基配对原则的。反应中模板与引物的结合(复性)由于聚合酶合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性能够在较高的温度下进行,大大增加了结合的特异性,也能够使得被扩增的靶基因片段的正确度保持在很高的水平。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区,从而获得更加高的特异性。
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