PCR的反应控制

PCR技术是模拟体内DNA的天然复制过程，在体外扩增DNA分子的一种分子生物学技术，主要用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2倍。

反应的控制

①PCR反应的缓冲液 提供合适的酸碱度与某些离子

②镁离子浓度 总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5mmol/L

③底物浓度 dNTP以等摩尔浓度配制，20～200umol/L

④TaqDNA聚合酶 2.5U(100ul）

⑤引物 浓度一般为0.1 ～ 0.5umol/L

⑥反应温度和循环次数

变性温度和时间 95℃，30s

退火温度和时间 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃

延伸温度和时间 72℃，1min/kb(10kb内）

Tm值=4(G+C) +2(A+T)

循环次数 ：一般为25 ～ 30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的 扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。

模板的制备

PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。

标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。