深蓝云干货课堂——如何抓住qPCR数据分析的关键

同学们又是做qPCR实验的一天，有没有怀着忐忑又期待的心情去点开“analysis”的呢？点开之后，发现扩增曲线不正常，或者Cq值过大，又或者SD值太高，那这样的实验结果还靠谱吗？现在让小编来告诉你，qPCR实验的成功与否，关键在于各组数据是否达到判定标准以及是否符合实验预期，小小的qPCR实验它可以变得很简单，也可以变得很复杂，如何抓住qPCR数据分析的关键，是分析qPCR结果可信度的diyi步。

qPCR数据分析的关键

qPCR数据分析主要是利用Cq值进行计算，所以我们需要了解qPCR反应中几个重要的参数，根据参数的表现来进行实验评估：

扩增曲线：图1反映的是荧光信号变化量的对数与qPCR反应循环数的关系。图2反映的是随着qPCR反应的进行相应的荧光信号的变化，比较直观，但是指数期很短。标准的扩增曲线是呈现出“S”型，具有特征性的形状：首先背景信号，然后是三个增长阶段（指数增长期、线性增长期和平台期）。

图1：扩增曲线对数图谱。图源：Azure Cielo qPCR系统。

图2：扩增曲线线性图谱。图源：Azure Cielo qPCR系统。

基线：通常3-15个循环时，荧光信号变化不大，变化趋势接近于一条直线，即扩增曲线的水平部分，这样的直线就是基线。同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线。

阈值：是一个荧光强度值，穿过阈值与X轴平行的直线称为阈值线，自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。手动设置是置于指数扩增期，刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值，但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值。

Cq值：qPCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数，与起始浓度的对数成线性关系。分析定量时一般取Cq:15-35，太大或者太小都会导致定量的不准确。

图3：扩增曲线。图源：Azure Cielo qPCR系统。

评估qPCR反应的效果

1、扩增效率及相关系数

为了正确地评估PCR扩增效率，至少需要做3次平行重复，并至少做5个数量级倍数(5logs)连续梯度稀释模板浓度。扩增效率E在90-110%之间时，认为扩增接近理想情况。

R²值：评估PCR效率的另一个关键参数，它是说明两个数值之间相关程度的统计学术语。如果R²等于1，则可以用Y值（Cq）来准确预测X值（初始模板量）。反之，如果R²等于0，就不能通过Y值来预测X值。一般认为，标准曲线的R²值大于0.98时，两个数值之间相关的可信度很好。

图4：标准曲线。图源：Azure Cielo qPCR系统。

2、重复性

重复性即是指精确度，反映多次测量值之间的接近程度。标准偏差（standarddeviation，偏差的平方根）是Z常用的精确度计量方法。如果许多数据点都靠近平均值，那么标准偏差就小；如果许多数据点都远离平均值，则标准偏差就大。例如，假设PCR反应效率是100%，那么2倍稀释点之间的平均Cq间隔应该恰为1个Cq值。要以99.7%的几率分辨2倍稀释浓度，标准偏差就必须小于等于0.167。为了能够在95%以上的情况下分辨出2倍稀释，标准偏差必须小于等于0.250。总的来说，重复孔之间的标准偏差不大于0.2，说明实验的重复性较好。

图5：8个重复孔的扩增曲线。图源：Azure Cielo qPCR系统。

3、重现性

指不同批次之间或不同实验室之间qPCR结果的变化，通常表示为拷贝数或Cq值的SD或CV。

图6：4台独立的Azure Cielo 仪器上检测GAPDH，Cq =20.11，SD= 0.002。

4、灵敏度

分析灵敏度是指一个样本中可通过实验精确测量的Z小拷贝数，而临床灵敏度是指在特定疾病患者们中，被检测确定为阳性的百分比。灵敏度为limit of detection（LOD），即在给定的分析程序中，可以确定且合理（通常使用95%的概率）检测得到的浓度，可通过梯度稀释样品来确定ZD检测限。LOD理论上Z小是3 copy/aliquot，这是由遵从泊松分布的取样误差导致的。假设符合泊松分布，那PCR有95%的可能性至少包含和检测到1个拷贝。

图7：5个数量级的动态范围检测。图源：Azure Cielo qPCR系统。

5、准确度

反映测量值和真实值的接近程度，以倍数变化或拷贝数进行估算。

6、特异性

指qPCR实验中只可以检测到目的基因，引物特异性扩增靶序列，而不会扩增其他基因序列。可通过凝胶电泳检测扩增产物是否为单一条带，或通过qPCR反应，根据溶解曲线是否具有单峰来判断。

图8：溶解曲线。图源：Azure Cielo qPCR系统。

Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统

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Azure  Cielo™性能展示

☑   高重现性和稳定性

连续1000次实验后，结果高度一致
GAPDH定量，Cq值=22.4±0.01

☑  高重复性

重复孔的扩增曲线高度重合

96孔重复结果（GAPDH），Cq平均值=19.1，

变异系数（Cv）=0.002。

☑   高分辨率

准确区分2倍浓度差异样品

人内参cDNA（GAPDH）进行10个梯度，

2倍稀释，3个重复，线性拟合度

R²=0.998，扩增效率E=99.89%