HCells实验系列（二）：成年大鼠心室肌细胞（ARVCs）分离与提取

??4.1 心脏取材与主动脉插管

完成麻醉后迅速开胸取出心脏，立即置于预冷的含钙Tyrode's溶液中清洗血液并去除多余组织。此时应快速定位主动脉（通常为最粗的血管），并完成主动脉插管及固定操作。

整个过程需尽量流畅，从开胸到开始灌流的时间应严格控制在2分钟以内，这是保证细胞活性的关键步骤。

??4.2 灌流系统启动与初始灌流

将心脏连接至Langendorff灌流系统后，启动灌流装置，在37°C恒温、持续供氧条件下进行恒流灌流。

通过蠕动泵控制灌流流速为6 mL/min（对应转速约20），首先使用含钙Tyrode's溶液进行灌流约2分钟，以充分冲洗残留血液。此阶段心脏通常会恢复跳动，系统压力一般维持在30 mmHg以上。

??4.3 无钙灌流与心脏停跳

随后切换至Buffer A（无钙Tyrode's溶液+牛磺酸）继续灌流约5分钟，逐渐降低细胞内钙水平，使心脏停止跳动，从而减少后续消化过程中的机械损伤。

??4.4 酶消化灌流

在心脏完全停止跳动后，切换至Buffer E（含胶原酶II）进行灌流。初始灌流约3分钟后进入循环灌流状态，持续进行组织酶解。

整个消化过程中需密切观察灌流压力变化，压力通常先升高后逐渐下降，并应控制在不超过30 mmHg范围内。当压力明显下降至5 mmHg以下时，提示组织已基本消化完成，应立即停止灌流 。

随后使用注射器向心脏内缓慢注入约10 mL Buffer A，以终止酶反应。

??4.5 心室组织分离与细胞分散

将心脏从灌流系统中取下，置于无菌培养皿中，剪取左心室组织（通常表现为较软塌区域）。加入适量KB溶液后，用镊子轻轻撕碎组织，并通过反复温和吹打，使组织逐渐分散为单细胞悬液。

该过程需保持操作轻柔，避免用力过大导致细胞结构破坏。

??4.6 过滤与离心

将获得的细胞悬液通过100 μm细胞筛网过滤，以去除未消化组织及杂质。随后进行低速离心（500 rpm，30秒）收集细胞沉淀，并弃去上清液。

??4.7 细胞纯化（自然沉降）

将细胞沉淀重悬于KB溶液中，在室温条件下静置约20分钟，利用不同细胞的沉降速度差异，使健康的杆状心肌细胞沉降，从而去除碎片及杂质细胞。

??4.8 梯度复钙

为恢复心肌细胞的钙耐受性，需进行分阶段复钙处理。

首先将细胞重悬于含1/3 Ca2?浓度的Tyrode's溶液中（可通过KB液与有钙Tyrode按比例混合实现），静置20分钟并自然沉降后弃上清；

随后进入2/3 Ca2?浓度条件，重复上述步骤；

最后使用全Ca2?浓度（约1.2 mM）Tyrode's溶液进行处理，同样静置约20分钟。

如复钙后细胞状态不佳或死亡细胞较多，可在全钙条件下适当重复重悬与沉降步骤，以提高细胞质量。

成年大鼠心室肌细胞的分离对操作节奏与细节控制要求较高，以下几个环节直接决定最终细胞质量：

??首先是时间控制。从开胸取心到开始灌流必须尽量缩短，建议控制在2分钟以内。若时间过长，心肌缺血会迅速影响细胞活性，导致后续获得的细胞状态不佳。

??其次是灌流状态的稳定性。灌流过程中需确保系统无气泡、管路通畅，同时保持恒温（37°C）和持续供氧。若出现灌流不畅或压力异常，往往提示插管位置不佳或血管堵塞，应及时调整。

??第三是消化程度的判断。不建议单纯依赖时间，而应以灌流压力变化作为主要依据。当压力明显下降至较低水平时，说明组织结构已被充分解离，此时应及时终止消化，避免过度酶解导致细胞损伤。

??在组织分散过程中，操作必须轻柔。吹打过于剧烈会导致细胞断裂或形态异常，影响后续实验。理想状态下应获得形态完整、呈杆状的心肌细胞。

??最后是复钙过程。梯度复钙不可省略或加快，过快恢复钙离子浓度容易引起细胞损伤甚至死亡。每一步均需给予足够时间，使细胞逐步适应钙环境变化。

HCells-Protocol

在实际操作过程中，常见问题多集中在灌流、消化及复钙三个阶段：

??1. 心脏灌流后不跳或跳动微弱

可能原因：插管位置不正确或灌流不通畅
解决方案：重新检查主动脉插管位置，确保灌流液能够进入冠脉系统，同时排除气泡干扰

??2. 细胞数量少或活率低
可能原因：取心时间过长或灌流不充分
解决方案：缩短取材时间，优化操作流程，确保快速进入灌流状态

??3. 细胞不呈典型杆状
可能原因：酶消化过度或机械损伤
解决方案：根据灌流压力判断消化终点，避免延长消化时间，同时减少吹打强度

??4. 细胞碎片多、杂质多
可能原因：组织分散不充分或过滤不彻底
解决方案：适当增加温和吹打次数，并确保使用细胞筛充分过滤

??5. 复钙后细胞大量死亡
可能原因：复钙过程过快或浓度变化过大
解决方案：严格按照梯度复钙步骤进行，每一步均给予充分时间

??6. 细胞收缩功能差或状态不稳定
可能原因：细胞损伤或环境不稳定
解决方案：检查灌流条件、温度及供氧情况，同时优化复钙过程

HCells-Protocol

??通过上述流程获得的成年大鼠心室肌细胞，具有良好的结构完整性和功能状态，可直接用于HCells系统中的多项功能检测实验。

??相较于乳鼠心肌细胞，ARVCs在收缩能力、肌节结构及钙处理等方面更加成熟，更适用于牵引力测定、钙瞬变分析及肌节运动检测等高精度功能实验。

??在实际应用中，建议优先选择形态完整、呈典型杆状的细胞进行后续接种，以保证实验数据的稳定性和可靠性。

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