HCells实验系列（一）：原代大鼠乳鼠心肌细胞（NRCM）分离与提取

??在心血管疾病研究与药物评价领域，原代心肌细胞始终是最具生理相关性的体外模型之一。相比于永生化细胞系，原代细胞能够更真实地反映心肌细胞的收缩功能、钙信号变化及力学特性，因此在功能性研究中具有不可替代的优势。

??在HCells多模态功能检测实验中，无论是牵引力、钙瞬变还是肌节运动分析，均依赖于细胞具备良好的结构完整性和功能活性。其中，原代大鼠乳鼠心肌细胞（Neonatal Rat Cardiomyocytes, NRCMs）因其获取相对稳定、成活率高、易培养等特点，成为常用模型。

??本实验的主要目的在于：

• 建立稳定、可重复的NRCM分离流程

• 获得高纯度、高活性的原代心肌细胞

• 为后续HCells功能检测实验提供可靠的细胞基础

HCells-Protocol

??4.1 心脏取材与预处理

将乳鼠在75%乙醇中短暂浸泡消毒后开胸取心，迅速转移至预冷PBS中清洗血液及杂质。在冰上使用剪刀将心脏组织尽量剪碎，以增加后续消化效率。

??4.2 组织消化

将组织块短暂离心后弃上清，加入预先配制并过滤的复合消化酶液（0.1%胰蛋白酶 + 0.08%胶原酶II）进行重悬。

在37°C水浴中结合磁力搅拌进行动态消化，每次约6分钟。

??4.3 分段收集与消化终止

每轮消化结束后，收集上清液并转移至含10% FBS的培养基中，以终止酶反应。

向剩余组织块中补加新鲜酶液，重复上述步骤约6次，直至组织基本完全解离 。

??4.4 过滤与离心

将所有消化液合并，经70 μm细胞筛过滤去除未消化组织。

随后在4°C条件下以300 × g离心5分钟，收集细胞沉淀 。

??4.5 重悬与差速贴壁

弃去上清后，使用完全培养基（DMEM + 10% FBS + 1%双抗）重悬细胞。

将细胞悬液转入培养皿中，在37°C培养箱中进行30–60分钟差速贴壁处理，以去除成纤维细胞 。

??4.6 细胞接种与培养

小心收集上清（富含心肌细胞），进行细胞计数后按实验需求接种。

常规培养约48小时，使细胞完成贴壁并恢复功能状态后，即可用于后续实验。

??低温操作至关重要：取材及剪碎过程需全程冰上操作，以降低细胞损伤

??消化时间控制：单次消化时间不宜过长，避免酶对细胞膜的破坏

??及时终止消化：每轮消化结束后需立即加入含血清培养基

??差速贴壁时间控制：时间过短纯度不足，过长则损失心肌细胞

??细胞恢复时间：建议培养≥48小时后再进行功能实验

??1. 细胞活率低
可能原因：消化时间过长或温度控制不稳定
解决方案：缩短消化时间，确保37°C恒温

??2. 成纤维细胞污染严重
可能原因：差速贴壁时间不足
解决方案：可适当延长差速贴壁时间至1小时；此外，也可在培养过程中加入适量 BrdU，通过抑制成纤维细胞增殖，提高心肌细胞纯度

??3. 细胞不收缩或状态差
可能原因：细胞未充分恢复或密度不合适
解决方案：延长培养时间，优化接种密度

??4. 贴壁不良
可能原因：培养基或基底条件不适
解决方案：优化培养条件，必要时使用功能化基底（如图案化水凝胶细胞培养板）