干货分享：手把手教你分离乳鼠心肌细胞

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实验准备

• 主要仪器：超净工作台、二氧化碳培养箱、水平离心机、磁力搅拌器。
• 关键试剂：PBS、DMEM培养基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、胶原酶II、青链霉素。
• 常用耗材：35 mm细胞培养皿、离心管（50/15/1.5 mL）、70 μm细胞筛网、无菌移液器吸头等。

• 试剂需提前预冷或预热，如消化酶液应在4 ℃预冷，培养基在37 ℃温育。
• 所有器材需严格灭菌（高压灭菌或紫外灭菌），避免杂菌污染。

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预处理环节

• 高温高压灭菌：手术器械、烧杯等高温高压灭菌 30 min。
• 紫外灭菌：不耐高温耗材（如移液器、细胞筛网）在超净台内紫外照射 30 min。
• PBS配置：PBS中加入1%双抗，4 ℃ 预冷备用。
• 消化酶液准备：配制胰蛋白酶（0.1%）+ 胶原酶II（0.08%），0.22 μm 过滤除菌，放置 4 ℃。

• 培养基：准备中和培养基（DMEM + 10% FBS）和完全培养基（DMEM + 10% FBS + 抗生素）。

• 消化酶浓度与预冷非常重要，浓度过高会导致细胞死亡，浓度过低则消化不完全。

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分离步骤

• 将乳鼠在 75% 乙醇中短暂浸泡消毒（约 5 秒）。
• 开胸取心脏，依次在含双抗PBS → 无双抗PBS（两次）中反复清洗，去除血液和杂质。
• 清洗后的心脏放入离心管备用。

• 清洗要彻底，否则杂细胞会过多，影响后续纯度。

• 将心脏组织剪碎（碎块越小，消化越充分）。
• 加入预冷的消化酶液，放入37 ℃ 水浴中，磁力搅拌消化约 6 min。
• 收集上清到含中和培养基的离心管中（避免吸取粘稠块）。
• 重复加酶 → 消化 → 收集，直至组织基本消失（通常约 6 次）。

• 消化次数 > 时间：一次长时间消化不如多次短时间效果好，细胞活性更高。
• 每次收集的上清都要立即中和，避免酶继续损伤细胞。

• 所有细胞悬液汇总后，经 70 μm 细胞筛网过滤，去除未消化杂质。
• 300×g 离心 5 min，弃去上清。
• （可选）再次中和重悬，以彻底清除残余酶液。

• 用完全培养基重悬细胞，接种到培养皿中。
• 先差速贴壁 30–60 min，去除贴壁快的成纤维细胞。
• 收集上清（心肌细胞为主），计数后均匀接种培养。
• 48 h 后，心肌细胞贴壁良好，可进行后续实验（牵引力检测、钙瞬变成像等）。

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注意事项与经验总结

• 无菌操作：全程在超净工作台操作，避免污染。
• 消化强度：过度消化会降低细胞活性，需严格控制。
• 成纤维细胞去除：差速贴壁是关键，时间过短去不干净，过长则心肌细胞流失。
• 细胞密度：过低会影响贴壁和生长，过高会导致营养不足。

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结语

在接下来的研究中，这些原代心肌细胞常常用于功能检测，例如牵引力测量、钙瞬变成像等。对于需要高通量、多参数同步分析的实验，传统手段往往效率有限。

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——The  End——