基因枪法介导 GUS 基因转入烟草脱外壁花粉的瞬时表达研究

一、引言

二、材料与方法

（一）植物材料

（二）脱外壁花粉的制备

1. 采集处于单核靠边期的烟草花蕾，用 70% 乙醇表面消毒 30 s，再用 0.1% HgCl₂消毒 8 - 10 min，然后用无菌水冲洗 3 - 4 次。

2. 将消毒后的花蕾在无菌条件下取出花药，置于含有 10% 蔗糖、0.01% 硼酸、0.5% 纤维素酶和 0.2% 果胶酶的酶解液中，在 28°C、黑暗条件下酶解 2 - 3 h。

3. 酶解结束后，通过 40 μm 滤网过滤除去杂质，收集花粉，用 15% 蔗糖溶液离心洗涤 2 - 3 次，得到脱外壁花粉，将其悬浮于适量的转化缓冲液中备用。

（三）基因枪转化

1. 质粒构建
   构建含有 GUS 基因的植物表达质粒，该质粒以 CaMV 35S 为启动子驱动 GUS 基因的表达，并含有筛选标记基因（如潮霉素抗性基因）。

2. 金粉准备
   称取 60 mg 直径为 1.0 μm 的金粉，悬浮于 1 mL 无水乙醇中，振荡混匀后离心收集金粉，用无菌水洗涤 2 - 3 次，最后将金粉重新悬浮于 1 mL 无菌水中，备用。

3. 微弹制备
   取 50 μL 金粉悬浮液，依次加入 10 μL 质粒 DNA（浓度为 1 μg/μL）、50 μL 2.5 M CaCl₂和 20 μL 0.1 M 亚精胺，振荡混匀后静置 10 min，离心收集沉淀，用 70% 乙醇和无水乙醇各洗涤一次，最后将沉淀重新悬浮于 60 μL 无水乙醇中。

4. 基因枪射击
   将适量的脱外壁花粉均匀涂布于培养皿中的固体培养基表面，待花粉稍干燥后，将制备好的微弹用基因枪（Bio - Rad PDS - 1000/He）按照设定的参数（如氦气压力 1100 psi、真空度 28 inHg、射击距离 6 cm 等）进行射击。

（四）GUS 基因瞬时表达检测

1. 组织化学染色
   在基因枪转化后 24 - 48 h，取部分转化后的花粉，加入 GUS 染色液（含有 1 mM X - Gluc、50 mM 磷酸钠缓冲液 pH 7.0、0.5 mM 、0.5 mM 、0.1% Triton X - 100），在 37°C 黑暗条件下染色 2 - 4 h。染色结束后，用 70% 乙醇脱色，在显微镜下观察并统计蓝色染色的花粉数量，以计算 GUS 基因的瞬时表达率。

2. 荧光定量分析
   提取转化后花粉的总 RNA，反转录合成 cDNA。以烟草 Actin 基因作为内参基因，设计 GUS 基因和 Actin 基因的特异性引物，采用实时荧光定量 PCR 技术检测 GUS 基因的相对表达量。反应体系按照 SYBR Green PCR Master Mix 试剂盒说明书进行配制，在荧光定量 PCR 仪上进行扩增反应，反应条件为：95°C 预变性 3 min；95°C 变性 10 s，60°C 退火 30 s，72°C 延伸 30 s，共 40 个循环。根据扩增曲线和熔解曲线分析数据，计算 GUS 基因相对表达量。

（五）转化条件优化实验

三、结果与分析

（一）脱外壁花粉的形态观察

（二）基因枪转化后 GUS 基因的瞬时表达

1. 组织化学染色结果
   通过 GUS 组织化学染色，在基因枪转化后的花粉中观察到部分花粉呈现蓝色，表明 GUS 基因在这些花粉中得到了表达。未转化的对照花粉则无蓝色出现。统计不同处理组中蓝色花粉的数量，计算得到 GUS 基因的瞬时表达率在不同条件下有所差异，范围为 5% - 25%。

2. 荧光定量分析结果
   荧光定量 PCR 结果显示，转化后的花粉中 GUS 基因的相对表达量明显高于未转化的对照花粉。不同转化条件下 GUS 基因的相对表达量变化趋势与组织化学染色得到的瞬时表达率基本一致，进一步证实了 GUS 基因在烟草脱外壁花粉中的成功导入和表达。

（三）转化条件优化结果

四、讨论

（一）脱外壁花粉在基因转化中的优势

（二）基因枪法在花粉转化中的应用

（三）GUS 基因作为报告基因的有效性

（四）研究的应用前景

五、结论