然而，传统识别“肿瘤反应性T细胞”（即能精准识别并攻击癌细胞的T细胞）的方法，主要依赖复杂、耗时的“新抗原”筛选，且许多有功能的细胞在体外难以扩增，导致大量有效细胞被漏检。
当单细胞测序遇见深度学习
面对这些挑战，一项由温州医科大学附属第一医院等团队联合完成的研究，开创性地整合了单细胞测序与深度学习技术，绕过了传统的新抗原筛选步骤，直接、快速地鉴定出胰腺癌中的肿瘤反应性CD8+T细胞。研究还采用了TCR-T细胞杀伤类器官模型与空间转录组学，在功能与空间层面双重验证了这些细胞的活性。
这种方法的核心优势在于大幅降低了识别肿瘤反应性T细胞的成本与时间门槛，为开发新型T细胞疗法开辟了高效的新路径。
CytoFLEX SRT奠定高质量数据基石
高质量的单细胞测序数据始于精准的细胞分选。研究团队在这一关键步骤中选择了CytoFLEX SRT流式细胞分选仪。在制备单细胞测序样本时，研究人员使用PE标记的抗人CD8抗体和DAPI对新鲜肿瘤组织制备的单细胞悬液进行染色。CytoFLEX SRT凭借其卓越的性能，将高活力的CD8阳性T淋巴细胞精准分选出来，作为后续单细胞RNA和TCR测序的起始材料。
CytoFLEX SRT流式细胞分选仪确保了单细胞测序数据来源于高度纯化的目标细胞群，极大提高了后续生物信息学分析的准确性和可靠性。这是构建高质量单细胞图谱和深度学习训练集的关键第一步，为整个研究奠定了数据质量基础。
CytoFLEX分析仪提供关键功能证据
在功能验证阶段，研究团队使用了CytoFLEX流式细胞分析仪，进行了两项重要实验：
在构建TCR-T细胞时，研究使用抗小鼠TCR β链抗体检测外源TCR在患者自体T细胞中的表达率，确认转染成功。这一步骤直接证实了深度学习模型预测出的TCR能够在T细胞上成功表达，为后续的功能验证奠定了基础。
图2：TCR-T细胞介导的对肿瘤类器官的细胞毒性作用
A：明场显微镜图像显示患者来源的肿瘤类器官 (WY_04) 在不同代次 (P0, P2, P3, P5) 的生长和形态变化。B：肿瘤组织和类器官的免疫组织化学分析，显示关键肿瘤标志物的表达。C：肿瘤类器官的多重免疫荧光分析，用于检测特定肿瘤标志物的表达。D：流式细胞术分析显示，转染后第8天，患者自体外周血淋巴细胞中外源TCR基因的表达阳性率。E：与TCR-T细胞共培养的类器官的代表性共聚焦显微镜图像，使用吖啶橙/碘化丙啶 (AO/PI) 染色以评估细胞活力和细胞毒性。Org：类器官。non-TR TCR-T control：非肿瘤反应性TCR对照组。F：与对照组 (Org & non-TR TCR) 相比，类器官数量的统计结果显示出显著差异 (Welch's t 检验: ** P<0.01; *** P<0.001)。G：TCR-T细胞与类器官共培养的IFN-γ ELISA检测 (Welch's t检验: *** P<0.001)。
研究人员用JC-1染料对持续活化的正常供者来源的T细胞进行染色，通过检测红色 (585 nm) 与绿色 (525 nm) 荧光信号的比例，定量分析线粒体功能状态。分析结果显示：持续激活超过72小时后，具有高膜电位的T细胞比例从超过70%下降到45%（图4G）。这一在正常T细胞模型中观察到的现象，为在肿瘤反应性CD8+ T细胞中发现的‘线粒体呼吸链相关基因下调’提供了重要的间接功能证据，支持了其可能存在代谢功能障碍的推论。
图4：人胰腺癌中TR CD8? T细胞的生物学特征
A：差异表达基因分析展示了不同亚型TR CD8? T细胞中上调与下调的基因。DEG：差异表达基因。B：冲突图展示了不同亚型TR CD8? T细胞在指定比较组之间重叠的GO通路。C：通过GSEA分析获得的TR CD8? T细胞相较于非TR T细胞（耗竭型和效应记忆型）转录组中差异表达基因集的富集图；p值通过单细胞GSEA的单尾置换检验确定。NES：标准化富集分数。D与E：韦恩图展示了通过调节子分析，在来自四名患者（TIPC249/309、P15及P20181121）的GZMK? Tem亚型TR CD8? T细胞中富集的FOS调节子。火山图显示了TIPC309患者的TR CD8? T细胞中显著上调的FOS (-) 调节子与显著下调的FOS (+) 调节子。F：整合基因组学查看器截图显示了初始T细胞与活化5小时后的T细胞中线粒体位点的开放染色质状态。纵轴显示了经比对读数归一化后的估计片段所覆盖的ChIP-seq范围。G：JC-1线粒体膜电位检测显示了T细胞持续活化过程中不同时间点的信号强度。
该研究取得了系列重要发现
代谢特征：肿瘤反应性CD8+T细胞普遍存在线粒体呼吸链功能受损，且受转录因子FOS调控。
新免疫检查点：首次在胰腺癌中系统揭示了TIGIT-NECTIN2轴是肿瘤微环境中的一个重要免疫抑制通路。
TCR特性：部分肿瘤反应性T细胞携带多重TCR组合，且实验证明，组合使用多个不同的TCR比单一TCR具有更强的肿瘤杀伤能力。
预后标志物：研究证实，肿瘤组织中肿瘤反应性CD8+T细胞的比例越高，患者接受新辅助免疫治疗的效果越好，总生存期也更长，使其成为潜在的疗效预测生物标志物。
可靠平台，驱动前沿发现
这项研究完美展示了从前沿科学问题提出，到技术创新突破，再到严格实验验证的完整闭环。CytoFLEX SRT分选仪与CytoFLEX分析仪构成的流式解决方案，贯穿了从“细胞精准取材”到“功能深度解析”的全过程，是确保研究结论坚实可靠的核心技术支柱。
在单细胞与人工智能驱动的生物医学研究新时代，流式细胞术作为连接“发现”与“验证”的关键实验平台，其价值日益凸显。贝克曼库尔特生命科学的CytoFLEX系列流式平台，以其卓越的性能与可靠性，将持续为全球科研人员在肿瘤免疫、细胞治疗等前沿领域的探索提供强大支持。
参考文献：
Sun, H., Shi, C., Fang, G. et al. Functional tumor-reactive CD8?+?T cells in pancreatic cancer. J Exp Clin Cancer Res 44, 253 (2025). https://doi.org/10.1186/s13046-025-03517-1
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