Dr.赛流式小课堂 | 一文囊括流式补偿的常见问题

流式细胞仪可以同时检测多个靶标，这是通过用不同荧光染料标记的抗体来实现的。虽然每种荧光染料都被设计为由特定波长的激光激发，并发射出特定波长范围的光，然而不同荧光染料的发射光波长范围会有重叠，这就是光谱重叠（图1）。而流式补偿就是一个在流式细胞分析中，用于校正荧光染料光谱重叠的数学过程，从而消除不同荧光染料发射光谱重叠带来的信号溢出，以确保检测到的信号真实来源于目标荧光团，从而获得准确的多色流式数据。

现在流式实验使用的荧光染料越来越多，光谱重叠越来越复杂，而补偿对于解析这种复杂的数据、从单个细胞中获取准确的多参数信息是不可或缺的。如图2中所呈现的，不做补偿或者没有正确的补偿，看到的数据是失真的，会导致错误的生物学解释和结论。Dr.赛建议Flowers绝大部分情况下流式实验都要进行补偿调节。

当然，如果能够确定所使用的染料之间没有光谱重叠的话，理论上确实是可以不调节补偿的。所以，Flowers要充分了解流式细胞仪的配置和染料的光谱，选择染料的时候需与仪器配置兼容，可以通过激光器优化选择来减少染料的信号溢漏。

得到的补偿值是基于特定的电压设置、抗体/染料组合、仪器状态和单染样本等等计算出来的，这些因素中的任何一个发生变化，补偿值就可能发生改变。如果依然沿用旧的补偿设置，很可能导致数据失真。所以，将“每次实验都调节补偿”作为一个必须遵守的标准操作规程，可以避免大部分因补偿不当导致的数据失真。

3. 补偿单染管信号与实验样本信号相比，要一样强或者更强。

5. 补偿单染管与样本的制备过程需要保持一致，每一个实验环节都有可能对荧光染料产生影响，从而影响补偿数值。例如，表面染色CD4之后需要固定破膜再染色胞内靶标，作为CD4的单染补偿染色后也需要进行固定破膜操作，从而跟样本保持一致。

因为补偿是一个数学过程，所以数值超过100%或者为负值都是有可能的。超过100%是比较常见的状况，这提示有可能光谱重叠导致的荧光溢漏比较严重，通过更高的补偿值来减去溢出信号。这也通常能够提醒Flowers流式方案的设计和染料的选择可能需要优化，或者仪器的设置尤其是荧光通道的电压设置需要优化。当然，即便补偿值超过100%，只要调节合适，也是可以的。而补偿值是负值的情况确实是不太常见的，往往提示实验流程中可能存在需要排查的问题，比如阳性群和阴性群存在差异显著的自发荧光，圈门有问题，仪器电压设置问题，串联染料的断裂等等。

流式实验中荧光染料的光谱重叠往往无法避免，尤其是对于多色流式实验，很多光谱重叠造成的影响可以通过优化配色方案和补偿来减小。但是，确实有些染料，由于光谱重叠过于强，要特别注意这些染料同时使用时的补偿调节。比如，APC与PE-Cy5；BV711，AF700，PE-Cy5.5，PerCP-Cy5.5； AMCyan和FITC等。还有很多染料，光谱极其接近，在传统流式细胞仪上是同一个通道检测的，这些染料是不能同时使用的。比如，FITC和AF488；APC， AF647和eFluor660；eFluor450，BV421和Super Bright 436；PE-eFluor610和PE-CF594；PerCP-Cy5.5和PerCP-eFluor710等。这类染料还有很多，针对自己不熟悉的染料，可以通过荧光光谱查看器（网址：www.thermofisher.cn/spectraviewer）和流式染料通道选择指南来了解染料的光谱信息和对应检测通道。