在表观遗传学研究中,DNA甲基化作为基因表达调控的核心机制之一,其检测技术的精准度直接影响科研与临床诊断的可靠性。当前主流的甲基化转化技术可划分为三大类:基于化学处理的亚硫酸氢盐转化、反向酶法转化EM-seq以及正向酶法转化TAPS。本文将从原理、流程、优缺点及前沿进展等维度,系统解析这三种技术的核心差异与应用场景。
亚硫酸氢盐转化
经典技术的双刃剑
技术原理与流程
亚硫酸氢盐转化(Bisulfite Conversion)是DNA甲基化检测的“金标准”,其核心原理是通过亚硫酸氢钠(NaHSO?)在酸性条件下对DNA进行化学修饰:未甲基化的胞嘧啶(C)被脱氨基转化为尿嘧啶(U),而甲基化的胞嘧啶(5mC)保持不变。后续通过PCR扩增将U转化为胸腺嘧啶(T),最终通过测序比对C/T比例确定甲基化状态。
典型流程
5 min-150 min转化;(翌圣生物推出5 min超快速转化试剂盒,极速转化);
30 min脱硫和洗涤;
5 min洗脱核酸。
技术优势与局限性
优 势
高灵敏度:转化效率可达99.5%以上,适用于微量样本(如cfDNA)。
成熟度高:自1992年首次应用以来,技术流程已高度标准化。
局限性
DNA损伤严重:亚硫酸氢盐处理会导致DNA链断裂,片段长度通常缩短至100-1000 bp,会丢失部分基因组信息。
碱基失衡:转化后GC含量降低,导致测序数据中AT占比过高,可能掩盖真实甲基化信号。
应用场景
肿瘤标志物检测:如肺癌中APC、RASSF1A基因启动子高甲基化。
发育生物学研究:追踪胚胎干细胞分化过程中的甲基化重塑。
反向酶法转化EM-seq
温和高效的新选择
技术原理与流程
EM-seq(Enzymatic Methyl-sequencing)是一种基于酶促反应的甲基化转化技术,其核心流程包括:
DNA甲基化保护
使用TET酶保护所有未修饰的C;
葡糖基化酶保护5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)。
非甲基化C脱氨
APOBEC脱氨酶将未甲基化的C转化为U;
甲基化的C(5mC)和羟甲基化的C(5hmC)被特异性保护。
技术优势与局限性
优 势
DNA损伤小:可保留10 kb以上的长片段DNA,适用于全基因组甲基化图谱绘制。
兼容性强:可与多种下游分析技术(如甲基化特异性PCR、质谱)结合。
局限性
成本较高:酶原料价格昂贵。
技术成熟度低:酶的稳定性弱于化学法。
应用场景
全基因组甲基化测序:分析复杂疾病(如神经退行性疾病)的甲基化调控网络。
单细胞甲基化研究:结合单细胞测序技术,解析细胞异质性。
肿瘤早筛:需要高灵敏度、低损伤的肿瘤早筛或液体活检项目。
正向酶法转化TAPS
精准区分甲基化修饰
技术原理与流程
TAPS(TET-assisted Pyridine Borane Sequencing)是一种基于氧化酶和化学还原的甲基化转化技术,其核心流程包括:
TET酶氧化
TET酶将5mC和5hmC氧化为5-羧基胞嘧啶(5caC);
未甲基化的C不受影响。
化学还原
吡啶硼烷将5caC还原为二氢尿嘧啶(DHU),后续PCR扩增中DHU转化为T。
技术优势与局限性
优 势
流程简化:酶法氧化+化学还原,减少操作步骤。
只转化5mC和5hmC:能保留基因组原来的信息。
兼容性强:适配全基因组测序、单细胞甲基化分析等。
碱基平衡:酶法转化不改变DNA的GC含量,测序数据质量更高。
局限性
转化效率波动:受酶活性影响,批间稳定性需验证。
应用场景有限:目前主要用于科研探索,临床转化较少。
转化率偏低:转化率≥85%。
应用场景
需要高灵敏度、低损伤的肿瘤早筛或液体活检项目。
需要一份样本同时检测甲基化和基因突变信息。
技术对比与展望
展 望
1. 多组学整合:将甲基化数据与转录组、蛋白质组数据结合,解析表观遗传调控网络。
2. 自动化与微型化:开发便携式甲基化检测设备,推动床旁诊断(POCT)应用。
探索表观遗传学的奥秘,翌圣生物提供全面的解决方案。我们精心研发的甲基化转化试剂和甲基化建库试剂,确保您在研究DNA甲基化模式时的精确性和可靠性。此外,翌圣的ATAC-seq和CUT-Tag技术,为解析复杂基因调控网络提供了强有力的工具。无论是基础研究还是临床应用,翌圣的表观遗传学原料都是您科研路上的坚实伙伴。
翌圣DNA甲基化解决方案
翌圣生物
翌圣生物科技(上海)股份有限公司成立于2014年,是一家聚焦生命科学产业链上游核心原料,从事核苷酸、蛋白、细胞和类器官四大品类生物试剂的研发、生产与销售的高新技术企业。公司兼备核心技术自主研发和规模化生产能力,核心产品数量达数千种,覆盖分子克隆、qPCR、NGS、体外转录、抗体、蛋白纯化及分析、细胞培养、转染、报告基因检测和类器官等多种系列,广泛应用于生命科学研究、诊断检测和生物医药等领域。
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