乳腺类器官培养手册

在全球范围内，乳腺癌(BC)是女性中最常被诊断出的恶性肿瘤，广泛了解正常乳房发育、癌变和疾病进展的潜在过程对于设计新的个性化疗法是必要的，但由于缺乏合适且广泛可用的体外模型阻碍了这一过程。

类器官是一种在体外3D培养并模拟体内器官的细胞结构，可以更准确地保留体内细胞的生物学特性和功能。乳腺类器官可以准确再现体内乳房微环境，并已被用于检查影响信号转导、基因表达和组织重塑的因素。

我们根据Clevers H发表的两篇文章^[1][2]，整理了乳腺组织生成乳腺类器官的培养方案。该模型可用于长期培养源自正常人乳腺组织或乳腺癌组织的类器官。

 图1.乳癌组织分化为乳腺类器官的过程(PMID: 33692550)^[2]

1.1将每个组织样本(<3-4 cm³)转移到装有D-BSA（DMEM GlutaMAX培养基中加入终浓度0.1%不含脂肪酸的BSA）的50 mL Falcon试管中，手术刀将组织切成0.5-1 mm³小块（组织块看起来均匀且有点粘稠）；

1.2 D-BSA重悬洗涤几次，静置后去除上清

1.3加入Type I型培养基，混匀，然后加入终浓度1 mg/mL的II型胶原酶和10 μM Y-27632，37°C消化1-2 h；

1.4 加入FBS终止消化，通过100 μm滤网过滤，450 g离心5 min去除上清；

1.5 如果沉淀物部分呈红色，加入红细胞裂解缓冲液，室温下孵育2 min，然后加入D-BSA，450 g离心5 min去除上清。

2.1 BME（基底膜提取物，也可用Matrigel替换）中重新悬浮细胞沉淀，混匀后，逐滴滴在12孔板中铺板，37°C倒置固化；

图2.BME滴在12孔板中的代表性图像(PMID: 33692550)^[2]

2.2 添加适量的Type I型(Advanced DMEM/F12，10% R-spondin1-conditioned medium，10% Noggin-conditioned medium，1×B27+VitA，10 mM Nicotinamide，1.25 mM N-acetyl-L-cysteine，100 μg/mL Primocin，5 μM Y-27632，5 nM Heregulin B1，5 ng/mL FGF-7，20 ng/mL FGF-10，0.5 μM A83-01，5 ng/mL EGF，1 μM SB202190)或Type II型培养基(Advanced DMEM/F12，20% Wnt3a-conditioned medium，10% R-spondin1-conditioned medium，10% Noggin-conditioned medium，1×B27+VitA，10 mM Nicotinamide，1.25 mM N-acetyl-L-cysteine，0.5 μg/mL Hydrocortisone，100 nM β-estradiol，10 μM Forskolin，100 μg/mL Primocin，5 μM Y-27632，5 nM Heregulin B1，20 ng/mL FGF-10，0.5 μM A83-01，5 ng/mL EGF)，37°C和5% CO₂的培养箱中继续培养，每2-4天更换一次培养基，7-21天后可进行类器官传代。

图3.用Type I型或Type II型培养基得到的乳腺类器官明场图像(PMID: 33692550)^[2]

图4.乳腺类器官代表性明场图像，太稀疏（左）、太密集（中）或密度适中（右）(PMID: 33692550)^[2]

[1] Sachs N, et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 2018 Jan 11;172(1-2):373-386.e10.

[2] Dekkers JF, et al. Long-term culture, genetic manipulation and xenotransplantation of human normal and breast cancer organoids. Nat Protoc. 2021 Apr;16(4):1936-1965.