本期智荟专线将为大家带来Biacore耗材选择的“保姆级攻略”，分为上下两篇，今天，先来一起了解配体的固定与捕获流程中的耗材选择。
Biacore是一种基于光学表面等离子共振原理（Surface Plasmon Resonance，SPR），用于分子互作分析的实验方法，其基本流程包含固定配体、分析物进样、芯片再生和数据分析。
当我们拥有一台Biacore仪器，需要做一对分子的互作分析时，如何根据互作分子的特性去选择芯片、缓冲液、各类试剂盒等耗材，是上机前必须解决的问题！
图1：Biacore实验的基本流程
传感芯片是Biacore实验最核心部件之一，Biacore拥有丰富的芯片家族，如CM5、CM7、CM4、CM3、PEG、C1、SA、NA、CAP、NTA、L1、HPA、Protein A/G/L 、PrismA和裸金芯片等17种芯片。
不同类型的芯片，其表面性质有所不同，适用范围包括蛋白质 - 蛋白质、蛋白质 - 核酸、蛋白质 - 小分子化合物、抗原 - 抗体等多种相互作用的检测和分析，在蛋白质组学、药物研发、免疫研究等领域发挥着重要作用。
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Tips
Biacore传感芯片分为两个系列，分别是“经典”传感芯片（Classic）和“S系列”传感芯片（Series S），二者的区别是芯片外壳形状不同，对应的Biacore机型不同，不符合机型的芯片无法插入仪器进行使用哦~
“S 系列”传感器芯片适用于Biacore 1K、1K+、1S+、8K+、8K、S200、T200 和4000系统；
“经典”传感芯片适用于Biacore X100、3000 和C系统；
我们称被固定或捕获在传感芯片上的分子为“配体”，流经芯片表面的分子为“分析物”。如何选择芯片，芯片之间有什么区别，多种实验方案如何选择，不同芯片固定或捕获配体过程中需要哪些试剂盒，接下来小编就带你一起看看吧~
蛋白、肽段、糖类、小分子
当一对互作分子其中有一个分子是蛋白、肽段、糖类、小分子，那么90%的互作都可以选择CM系列芯片，包含CM5、CM7、CM4、CM3。其具有羧基化葡聚糖表面，当配体带有-NH2，-SH，-CHO，-OH，-COOH基团，即可通过共价偶联的方式固定在芯片表面。通过共价偶联的配体无法再从芯片上分离下来，是不可逆的固定。
CM5和CM7芯片：CM5芯片是蛋白质偶联的第一选择，在此基础上，CM7芯片的葡聚糖链更长，羧甲基含量更高，因此可以实现更高的偶联量，更加适用于蛋白和小分子的互作。当蛋白和小分子之间分子量比大于200时，建议选择CM7芯片。
CM3和CM4芯片：这两种芯片的固定水平通常约为CM5芯片固定水平的30%左右，CM4芯片羧基化程度低于CM5芯片，即携带的负电荷相对较少，能减少对带高正电荷蛋白的非特异性结合，易得到较低的Rmax，便于进行动力学研究，可用于检测蛋白、蛋白复合体或细胞裂解液等样品。CM3芯片与CM5芯片的羧基化程度相同，但葡聚糖链长度比CM5短，降低了空间位阻，适用于低偶联量的互作分析，以及分析物为大分子、颗粒物的互作，例如细胞、病毒和分子复合物。
图2：CM7、CM5、CM4、CM3芯片表面结构示意图
细胞、病毒等大分子颗粒
除去上文提到的CM3芯片，还可以运用C1和PEG芯片完成如细胞、病毒等大分子、 分子复合物、多价体和分子颗粒的互作。
C1芯片：芯片是羧基表面，无葡聚糖支链，能避免葡聚糖链引起的空间位阻，其固定水平通常约为CM5芯片的10%。但是由于C1芯片表面的亲水性低于CM5传感芯片，这可能会导致某些样品的非特异性结合增加。
PEG芯片：芯片是带有羧基平铺的聚乙二醇表面，无葡聚糖支链，最大的特点是具有超低的非特异性吸附。通常它的固定量为1000 Ru左右，说明书中有固定的氨基共价偶联条件，不需要做pH scouting。
以上提到的所有芯片（CM5、CM7、CM4、CM3、C1、PEG）都可以通过氨基偶联、醛基偶联、巯基偶联、马来亚酰胺偶联等方法将配体固定在芯片上。
由于芯片表面带负电（pK=3.5），Biacore提供pH 4.0-5.5的醋酸钠偶联缓冲溶液用于稀释配体分子使其带正电（偶联缓冲溶液pH值需小于配体分子等电点），以完成配体分子的预富集。在正式偶联之前建议进行pH scouting，挑选满足静电吸附且温和的pH预富集条件。
Biacore提供两种直接共价偶联的试剂盒，分别是氨基偶联试剂盒和巯基偶联试剂盒。一个氨基偶联试剂盒至少可以完成100次偶联，一个巯基偶联试剂盒可以完成30-50次的偶联，且具有单独的PDEA补充试剂盒。
带标签分子
针对一些具有“特殊身份”的配体分子，Biacore提供多种固定方案可供选择。
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带His标签的分子作为配体有三种固定方式：
CM系列芯片+氨基偶联试剂盒：直接随机不可逆的共价偶联His标签分子，适用于分析物配体分子量差距大，需要高固定量的蛋白和小分子互作。
CM系列芯片+氨基偶联试剂盒+His捕获试剂盒：需要运用氨基偶联试剂盒将抗His抗体共价固定在芯片上，再通过抗His抗体捕获带His标签配体分子，相当于自制的捕获芯片，具有配体固定的定向性。可以通过再生步骤，更换不同的His标签蛋白，实现可逆的固定。His捕获试剂盒带有固定缓冲液和再生试剂，省去了优化固定和再生条件的步骤，适用于偶联量不高但对配体固定稳定性有一定要求的互作。
NTA芯片+NTA试剂盒：NTA芯片在羧基化葡聚糖表面包被氨三乙酸（NTA），通过金属离子螯合作用可以捕获带His标签的配体分子，捕获量可以达到3000-4000 Ru。NTA芯片的优势在于可以多次捕获不同的带His标签蛋白，实现可逆的固定，无需自己固定抗His抗体。NTA试剂盒中配有螯合试剂（0.5mM NiCl2）和再生试剂（350mM EDTA），省去条件优化的步骤。
另外，NTA芯片带有未修饰的羧甲基，同样可用于共价固定，其方式与CM系列芯片相同，偶联量同CM5。如果通过金属螯合法捕获的配体不够稳定，则可以在镍注射后和配体注射之前用氨基偶联试剂活化芯片表面，这种方法可以增加His标签分子配体的捕获量和稳定性。捕获配体的方法适用于蛋白等电点低，低pH条件下不稳定，无法通过静电吸附进行预富集的蛋白样品，详见下图。
图3：如何选择共价偶联和捕获
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带生物素标签的分子作为配体有三种固定方式：
对于核酸、糖类、多肽等不利于常规偶联的样品，可以通过试剂盒添加生物素标签，再被捕获到SA、NA或CAP芯片表面，捕获完配体后不用进行封闭，可直接上分析物进行分析。
表1：生物素标签分子的3种固定方式
CAP芯片是通过在链霉亲和素上连接一段寡聚核苷酸，形成生物素捕获分子，通过核酸互补配对与芯片连接，如图4所示。CAP芯片不单独售卖，仅提供Biotin CAPture 捕获试剂盒，该试剂盒中含有CAP芯片、生物素捕获试剂与再生试剂，生物素捕获试剂可另外单独购买。
图4：SA、NA、CAP芯片表面结构示意图
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带GST标签的分子作为配体的固定方式：
CM系列芯片+氨基偶联试剂盒+GST捕获试剂盒：需要运用氨基偶联试剂盒将抗GST抗体共价固定在芯片上，再捕获带GST标签配体分子，试剂盒中还包含了重组GST，可以作为阳性对照或竞争性抑制剂。
抗体类分子
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抗体作为配体有多种固定方式：
Protein A/G/L芯片：羧基化的葡聚糖表面共价偶联Protein A/G/L蛋白，Protein A/G芯片只结合抗体Fc区，保证了抗体结合的定向性。Protein L可结合抗体片段，如Fabs、scFv、dAbs，抗体结合范围比Protein A/G更宽泛。关于Protein A/G/L对不同种属抗体亚型的亲和力强弱，请扫描文末二维码查看~
CM系列芯片+氨基偶联试剂盒+抗体捕获试剂盒：需要运用氨基偶联试剂盒先将对应抗抗体共价固定在芯片上，再捕获对应抗体。Biacore提供鼠抗、人抗、人Fab片段捕获试剂盒，当Protein A/G/L与某种抗体的亲和力弱导致芯片捕获量低，或抗体样品不纯，成分复杂时，例如使用牛血清为培养基表达产生的鼠源抗体或抗体片段，建议使用抗体捕获试剂盒提高捕获的特异性和稳定性。也可以在CM系列芯片上自己固定对应的抗抗体制成捕获芯片。
PrismA芯片（S系列）：羧基化的葡聚糖表面共价偶联改造的耐碱Protein A蛋白（与Mabselect PrismA填料配基一致），对重链VH3的亲和力增强，结合多种哺乳动物的抗体，推荐用于抗体滴度和浓度测量。
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针对抗原抗体互作分析，一般建议固定抗体为配体，抗原作为分析物并控制Rmax＜100 Ru。当由于某些原因只能固定抗原为配体时，为避免抗体作为分析物出现“舞蹈效应”造成难以解离的情况，会建议更低水平的偶联，并控制Rmax＜30 Ru。
脂质分子
HPA芯片：芯片具有疏水性烷烃硫醇涂层，无葡聚糖基质，囊泡或脂质体可吸附至表面形成脂质单层，疏水端朝向金膜，亲水端朝向水溶液样品，适用于脂质单分子层和膜结合蛋白的相互作用。
L1芯片：芯片表面在葡聚糖基质载有疏水结构，可插入脂质体，从而将膜吸附于葡聚糖基质，适于研究跨膜受体蛋白在膜环境内的相互作用。
两种芯片最主要的区别是：脂质体或囊泡在HPA芯片上形成脂单分子层，不适合固定嵌入膜结构较深的膜蛋白或者跨膜蛋白；L1芯片则可以支持脂双层结构的形成，可用于固定完整膜结构中的配体。另外，有关于膜蛋白的互作研究，也可以单独表达膜蛋白互作区域，用CM系列芯片固定膜蛋白，需要在缓冲体系中加入一定量的去垢剂促溶。
图5：L1芯片表面结构示意图
特殊分子量身定制
裸金芯片试剂盒：包含10个裸金传感器表面和芯片支架，以及组装工具包和配件，具有未经处理的金膜表面，用于设计和创建独特的表面化学修饰。
小结
本文主要介绍了Biacore实验固定配体流程中所使用的耗材和试剂，欢迎扫码查看详细产品目录和《Biacore 芯片与耗材选择指南》。
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在下篇中将会继续分享分析物进样、芯片再生、后期维护流程中的耗材选择，预祝大家实验顺利~
更多相关问题，欢迎拨打智荟专线400-810-9118，转2号线进行咨询。
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? “芯”发现：CM系列芯片的多种玩法
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