明星客户案例 | 明捷医药使用FFF-MALS系统进行GLP-1类似物寡聚化研究

胰高血糖素样肽-1 (GLP-1) 是一种由31个氨基酸组成的多肽，具有增强胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌，从而发挥降低血糖的作用。然而，内源性GLP-1易受二肽基肽酶-4（DPP-4）和中性肽链内切酶（NEP）快速降解，血浆半衰期仅1.5-2分钟，严重限制其临床应用。

为了应对这一问题，科学家对GLP-1进行定向改造，设计出GLP-1类似物——利拉鲁肽，通过两处关键结构修饰实现药效优化，延长药物的半衰期，用于治疗Ⅱ型糖尿病和肥胖症。

▲ 利拉鲁肽氨基酸序列图

"Oligomerization of a Glucagon-like Peptide 1 Analog: Bridging Experiment and Simulations." Biophysical Journal 109.6(2015).

不受控制且过度的寡聚化可能导致纤维化聚集，影响药物稳定性，了解利拉鲁肽的寡聚化状态至关重要。溶液结构是确保制剂稳定性及液态剂型长期保存的关键因素，为了深入探究利拉鲁肽的溶液分子构象，丹麦理工大学Frederiksen等人开展了分子动力学(MD)模拟，并通过多角度光散射（MALS）和小角X射线散射（SAXS）实验进行验证。今天，我们就一起探究下多角度光散射（MALS）在本次研究中的具体应用。

样品：利拉鲁肽注射液，诺和诺德公司生产，含18mg 利拉鲁肽（游离碱，无水物）。

仪器：FFF-MALS (Wyatt, Santa Barbara, CA, USA), SAXS

本研究使用了Eclipse AF4分离系统进行不对称流场流分馏(AF4)分离，检测器包括280 nm波长的紫外检测器以及一台 Dawn Heleos-I 18-角度多角度激光散射(MALS)检测器。

在配备S-350 μm 间隔片、长度为17.5 cm 的分离通道中，使用截留分子量为10 kDa的聚醚砜(PES)膜，进行分离操作。将样品以 0.2 mL/min 的流速引入分离通道，随后在通道头部以 1.5 mL/min 的聚焦流速进行聚焦。样品在 15分钟内洗脱，通道流速为 1 mL/min，横流梯度为 4.0-2.5 mL/min。分别进样未稀释的利拉鲁肽注射液（利拉鲁肽浓度为 6 mg/mL）和 10倍稀释(洗脱液稀释)的利拉鲁肽注射液，洗脱液为含 20 mM 磷酸盐、100 mM 氯化钠和 0.05% 叠氮化钠、pH值为8.1的溶液，经 0.1 μm 滤膜过滤。

使用不同进样体积的未稀释和稀释后的利拉鲁肽注射液，得到的利拉鲁肽质量负载分别为6、12和18 μg。利拉鲁肽的分子量使用 ASTRA 软件进行计算，其中折光指数增量（dn/dc）设置为 0.185 mL/g，紫外消光系数（280 nm）设置为 6990 cm?1 M?1。

对利拉鲁肽的分析表明，在所有的分析中均呈现单峰和均匀的分子量（左），这表明在检测器所检测的浓度范围内，排斥行为可忽略不计。整个峰的平均分子量为 22 kDa，若假定单体分子量为 3.7  kDa，对应于假设单体分子质量为3.7 kDa的六聚体。分析未稀释的Victoza (6 mg/mL利拉鲁肽)和10稀释的Victoza，使用不同的进样体积，得到6、12和18 μg利拉鲁肽的质量负荷。在分析过程中，利拉鲁肽被洗脱液稀释，并且对在通过紫外检测器的洗脱液中得到的利拉鲁肽浓度进行定量（右）。观察到利拉鲁肽的峰浓度分别为 0.012 mg/mL、0.024 mg/mL和 0.036 mg/mL。

根据利拉鲁肽单体分子量 3.7 kDa，MALS结果表明利拉鲁肽的溶液结构为六聚体，在0.012-0.036 mg/mL浓度范围内，未观察到低聚物之间的排斥相互作用。

FFF-MALS 可以在非破坏的情况下直接测定利拉鲁肽绝对分子质量，该方法也符合CDE在《胰岛素类产品生物类似药药学研究与评价技术指导原则》对高级结构表征的监管要求。

明捷医药为更好的服务客户，提供高质量药物研究服务，实验室现已引进场流FFF-MALS 设备，可对GLP-1类似物如利拉鲁肽、司美格鲁肽等进行聚集化研究，快速准确测定分子质量（六聚体）及质量分布，监测药物的稳定性和安全性，欢迎业内伙伴咨询~