多囊肾病囊肿衬里上皮细胞系创新研究

一、引言

多囊肾病作为一种复杂的遗传性肾脏疾病，以双侧肾脏出现多个囊肿为主要特征，囊肿进行性增大，逐渐破坏肾脏的正常结构和功能。目前，PKD 的发病机制尚未完全阐明，这给临床治疗带来了巨大挑战。囊肿衬里上皮细胞作为囊肿形成和扩张的关键参与者，其异常的增殖、分泌和细胞间信号转导在疾病进程中发挥核心作用。研究这些细胞对于揭示 PKD 的奥秘至关重要，然而，从体内获取和研究这些细胞存在诸多困难，因此建立稳定可靠的多囊肾病囊肿衬里上皮细胞系成为当前研究的热点和关键方向。这不仅可以为深入了解 PKD 的病理生理机制提供理想的细胞模型，还能为药物筛选和基因治疗等研究开辟新的途径。

二、材料与方法

（一）样本来源

患者选择

从临床确诊为多囊肾病的患者中获取肾脏囊肿组织样本。患者年龄在 20 - 60 岁之间，涵盖不同疾病阶段，包括早期囊肿形成和晚期肾功能受损的患者。在获取样本前，均获得患者的知情同意，并经过伦理委员会批准。

组织采集

在手术切除囊肿或囊肿穿刺活检过程中，收集新鲜的囊肿衬里上皮组织。将组织迅速置于含有低温保存液（如 Hank's 平衡盐溶液与 10% 二甲基亚砜混合液）的无菌容器中，并在短时间内转运至实验室进行处理。

（二）细胞分离与培养

组织处理

将采集到的囊肿衬里上皮组织在无菌超净台中用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）反复冲洗，去除血液、黏液和其他杂质。然后，使用眼科剪将组织剪成约 1 - 2mm³ 的小块。

酶消化法分离细胞

将组织小块置于含有 0.25% 胰蛋白酶 - 0.02% EDTA 混合消化液的离心管中，在 37℃恒温水浴中轻轻振荡消化。消化时间根据组织块的大小和质地进行调整，一般为 20 - 30 分钟。期间，每隔 5 - 10 分钟取出离心管，用吸管轻轻吹打组织块，使细胞充分解离。消化完成后，加入含有 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 培养基终止消化反应。

细胞培养

将消化后的细胞悬液通过 200 目滤网过滤，去除未消化的组织碎片。滤液以 1000rpm 的转速离心 5 分钟，弃去上清液。用含有 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 链霉素、2mmol/L - 谷氨酰胺和多种生长因子（如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子等）的特殊培养基重悬细胞。将细胞接种于预先用胶原蛋白 I 或纤维连接蛋白包被的培养瓶中，置于 37℃、5% CO₂ 的培养箱中培养。在培养初期，密切观察细胞贴壁和生长情况，每 2 - 3 天更换一次培养基。

（三）细胞系的建立与鉴定

细胞传代

当原代细胞生长至 80% - 90% 汇合度时，进行传代培养。弃去培养瓶中的旧培养基，用 PBS 轻轻冲洗细胞两次，加入适量的 0.25% 胰蛋白酶 - 0.02% EDTA 消化液，在 37℃下消化至细胞变圆、开始脱落。加入含血清培养基终止消化，将细胞悬液转移至离心管中，离心后重悬细胞，并按照一定比例接种于新的培养瓶中。

细胞鉴定

形态学观察

使用倒置相差显微镜定期观察细胞的形态特征，包括细胞大小、形状、细胞核形态和细胞间连接等。多囊肾病囊肿衬里上皮细胞呈多边形或椭圆形，细胞边界清晰，核大而圆，可见明显的核仁，部分细胞有双核或多核现象，与体内囊肿衬里上皮细胞的形态相似。

免疫细胞化学染色

利用针对多囊肾病囊肿衬里上皮细胞特异性标志物的抗体，如多囊蛋白 - 1（PC - 1）、多囊蛋白 - 2（PC - 2）、上皮细胞黏附分子（EpCAM）等进行免疫细胞化学染色。将细胞接种于载玻片上，培养至适当密度后，进行固定、通透处理，然后依次加入一抗、二抗和显色剂。阳性细胞呈现特异性的颜色反应，通过显微镜观察并统计阳性细胞比例，以确定细胞系的纯度和特异性。

基因表达分析

提取细胞系的总 RNA，通过逆转录 - 聚合酶链反应（RT - PCR）和实时定量聚合酶链反应（qPCR）检测多囊肾病相关基因（如 PKD1、PKD2 等）的表达水平。同时，检测细胞特异性标志物基因的表达情况，与正常肾脏上皮细胞进行对比，进一步验证细胞系的来源和特性。

染色体分析

对细胞系进行染色体核型分析，以评估细胞在长期培养过程中的遗传稳定性。采用秋水仙素处理细胞，使细胞停滞在有丝分裂中期，然后制备染色体标本，通过 Giemsa 染色观察染色体数目和形态结构的变化。

（四）细胞功能研究

细胞增殖能力测定

MTT 法

将细胞接种于 96 孔板中，每孔细胞数为 5×10³ 个。培养一定时间后，加入 MTT 溶液（5mg/ml），继续培养 4 小时。然后弃去上清液，加入 DMSO 溶解结晶物，使用酶标仪在 570nm 波长处测量吸光度值。根据吸光度值绘制细胞生长曲线，分析细胞的增殖能力。

BrdU 掺入实验

将细胞培养于含有 BrdU（5 - 溴 - 2'- 脱氧尿苷）的培养基中，BrdU 可在细胞增殖过程中掺入新合成的 DNA。培养一段时间后，固定细胞，使用抗 BrdU 抗体进行免疫荧光染色，通过荧光显微镜观察并计数 BrdU 阳性细胞的比例，以评估细胞的增殖活性。

细胞分泌功能研究

收集细胞培养上清液，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）方法检测细胞分泌的与 PKD 相关的因子，如血管内皮生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶（MMPs）等的含量。同时，通过 Western blotting 分析细胞内这些分泌蛋白的表达水平，以了解细胞的分泌功能及其调控机制。

细胞信号转导研究

Western blotting

提取细胞总蛋白，通过 SDS - PAGE 电泳分离蛋白，转印至 PVDF 膜上，然后分别用针对不同信号通路关键蛋白（如 Akt、ERK、mTOR 等）的抗体进行免疫印迹分析。观察这些蛋白的磷酸化水平和表达量变化，以了解细胞内信号转导的激活情况。

免疫共沉淀实验

为了研究细胞内蛋白 - 蛋白相互作用，采用免疫共沉淀实验。将细胞裂解后，加入针对目标蛋白（如 PC - 1 和 PC - 2）的抗体，与细胞裂解物在 4℃下孵育过夜。然后加入 Protein A/G 琼脂糖珠，继续孵育，离心收集琼脂糖珠 - 抗体 - 蛋白复合物。通过 Western blotting 检测复合物中与目标蛋白相互作用的其他蛋白，以揭示细胞信号转导网络中的关键分子机制。

三、结果

（一）细胞系的建立

经过多次尝试和优化培养条件，成功建立了多囊肾病囊肿衬里上皮细胞系。该细胞系在长期培养过程中保持稳定的生长状态，可连续传代超过 30 次，且细胞形态和生长特性无明显改变。

（二）细胞系的鉴定结果

形态学鉴定

细胞在培养过程中呈现出典型的多囊肾病囊肿衬里上皮细胞形态，与体内观察到的细胞特征相符，证明所建立的细胞系具有较高的纯度。

免疫细胞化学染色

免疫细胞化学染色结果显示，细胞系中 PC - 1、PC - 2 和 EpCAM 等标志物呈阳性表达，阳性细胞比例高达 90% 以上，进一步证实了细胞系的特异性。

基因表达分析

RT - PCR 和 qPCR 结果表明，细胞系中 PKD1、PKD2 等多囊肾病相关基因表达水平显著高于正常肾脏上皮细胞，同时细胞特异性标志物基因表达稳定，从基因水平验证了细胞系的来源。

染色体分析

染色体核型分析显示，细胞系染色体数目和结构在长期培养过程中保持稳定，未出现明显的染色体异常，表明细胞具有良好的遗传稳定性。

（三）细胞功能研究结果

细胞增殖能力

MTT 法和 BrdU 掺入实验结果均显示，多囊肾病囊肿衬里上皮细胞系具有较强的增殖能力，明显高于正常肾脏上皮细胞。细胞生长曲线呈典型的 “S” 型，在培养 2 - 3 天进入对数生长期，持续增殖至 5 - 6 天达到平台期。

细胞分泌功能

ELISA 和 Western blotting 结果表明，细胞能够大量分泌 VEGF、MMPs 等与囊肿形成和发展密切相关的因子。这些因子的分泌水平在不同培养条件下呈现出一定的变化规律，提示细胞分泌功能受到多种因素的调控。

细胞信号转导

Western blotting 分析显示，细胞内 Akt、ERK、mTOR 等信号通路关键蛋白的磷酸化水平明显升高，表明这些信号通路在多囊肾病囊肿衬里上皮细胞中处于激活状态。免疫共沉淀实验发现了 PC - 1 和 PC - 2 之间以及它们与其他信号分子之间存在复杂的相互作用，为进一步解析 PKD 的信号转导网络提供了重要线索。

四、讨论

（一）细胞系建立的意义

本研究成功建立的多囊肾病囊肿衬里上皮细胞系为 PKD 的研究提供了一个理想的体外模型。与以往使用的动物模型或原代细胞培养相比，该细胞系具有可重复性强、细胞纯度高、遗传稳定等优点。它能够更准确地模拟体内囊肿衬里上皮细胞的生理和病理状态，为深入研究 PKD 的发病机制提供了有力工具。

（二）细胞特性与疾病机制的关联

细胞增殖与囊肿形成

细胞系表现出的较强增殖能力与多囊肾病囊肿的不断增大和增多密切相关。异常激活的细胞增殖信号通路可能是导致囊肿衬里上皮细胞过度增殖的原因，这为寻找抑制细胞增殖的治疗靶点提供了依据。

细胞分泌与囊肿发展

细胞大量分泌 VEGF、MMPs 等因子，这些因子在囊肿周围血管生成、细胞外基质重塑等过程中发挥重要作用。通过对细胞分泌功能的研究，可以进一步了解囊肿的发展机制，并探索通过调节细胞分泌来控制囊肿进展的策略。

细胞信号转导与疾病复杂性

细胞内复杂的信号转导网络，尤其是 PC - 1 和 PC - 2 参与的信号通路，揭示了 PKD 发病机制的复杂性。这些蛋白不仅参与调节细胞的基本生理功能，还通过与其他信号分子的相互作用影响整个细胞的行为，为全面解析 PKD 的分子机制提供了新的视角。

（三）研究的局限性和未来方向

局限性

尽管建立的细胞系具有诸多优点，但仍存在一定局限性。例如，体外培养环境可能无法完全模拟体内复杂的微环境，这可能会影响细胞的某些生理功能和信号转导。此外，细胞系在长期培养过程中可能会发生一些潜在的适应性变化，需要进一步监测和评估。

未来方向

未来的研究可以进一步优化细胞培养条件，尝试构建更接近体内环境的三维培养模型。同时，可以利用基因编辑技术对细胞系进行基因修饰，研究特定基因在 PKD 发病机制中的作用。此外，基于细胞系开展大规模的药物筛选和药物作用机制研究，有望为多囊肾病的治疗带来新的突破。

五、结论

本研究通过创新的方法成功建立了多囊肾病囊肿衬里上皮细胞系，并对其进行了全面的鉴定和功能研究。该细胞系的建立为多囊肾病的发病机制研究、治疗靶点发现和药物研发提供了重要的细胞模型和实验依据。虽然目前研究还存在一定局限性，但为未来的 PKD 研究开辟了新的途径和方向，有望推动多囊肾病治疗领域的进一步发展。