无需负染直接观察！科学家用台式透射电子显微镜揭示周围神经病变真相！

周围神经病（PN）是指周围运动、感觉和自主神经的功能障碍和结构改变所致的一组疾病，严重干扰着患者的日常活动和生活质量。采用PN动物模型来研究PN的发病机制与治疗方法是一种较好的科研手段，而周围神经病一直缺乏能够充分表征长度相关性神经损伤的动物模型。

有鉴于此，近日意大利米兰神经科学中心的Guido Cavaletti与Paola Alberti团队使用神经传导研究与电子显微镜观察相结合的模式研究了轴突周围神经病变动物模型中大鼠腹尾神经的形态功能特征，文章以Morpho-Functional Characterization of the Rat Ventral Caudal Nerve in a Model of Axonal Peripheral Neuropathy为题发表在MDPI期刊中。

LVEM25低电压台式透射电子显微镜观察离体尾神经的成像结果显示，在PN动物神经的Z近端部分（下图A），大多数神经纤维仍显示正常外观，而在神经中部（下图B），变性轴突清晰可见。在神经的Z远端部分（下图C），PN动物表现出严重的轴突损失，以及轴突病变的一些残留迹象，这与研究者之前基于长期 PTX化疗的PN模型的研究结果一致，研究者观察到细胞从神经内膜血管迁移到神经内膜，这些细胞很可能成为浸润性巨噬细胞 （下图D）。

图2. 在周围神经病变 (PN) 组中观察到的神经长度依赖性损伤的代表性图像。

 (A)：尾巴根部的图像。(B)：尾巴中部的图像。(C)：尾尖处的图像。

 (D)：单核细胞离开血管区室，成为远端部分之一的组织巨噬细胞。

该研究中，研究人员使用透射电子显微镜对大鼠腹尾神经轴突进行形态学观察来评估神经损伤程度。在传统神经生物样品研究中，透射电子显微镜需要对切片进行负染，负染过程本身可能对生物样品造成损伤；且对不同的神经生物样品，染料的种类、浓度、负染时间均需要进行预实验来进行探索，造成了整个实验流程的复杂化。在本研究中，研究者使用的LVEM25低电压台式透射电子显微镜无需负染，可直接对神经样品进行观察，更加真实地展现了神经样品的形貌特征。LVEM25低电压台式透射电子显微镜采用25kV低加速电压设计，对生物样品不会造成任何损伤，无需负染，也无需复杂的冷却、真空系统，且小型台式设计可以放置在任意实验室内，摆脱了传统透射电镜的成像难题，提高了样品成像的衬度/反差（见上图）。

PTX处理前对全部的大鼠进行全尾长度的NCS检测以确定检测基线，C0为鼠尾根部，C1为距离鼠尾根部1 cm处，C2为距离鼠尾根部3 cm处，以此类推。所得结果如下：

图3. NCS检测基线

化疗处理结束时，从尾部基部开始进行NCS检测，在PN动物中记录C0后立即观察到以SNAP 振幅显著降低为代表，与轴突损伤相一致的数据变化。当研究者从近端到远端进行连续记录时，观察到神经损伤的严重程度随长度而增加。损伤严重程度逐渐向远端增加，直至所有PN动物中在 C8 均未记录到任何数据。（见下图左）。通过观察 CTRL 动物尾部的解剖结构可以发现， PN组表现出相同的特性，对侧尾静脉的仔细检查没有发现对静脉给药有任何局部反应，证实 PN 动物的轴突病变不是由局灶性神经损伤引起的，而可能是由重复静脉给药导致的神经毒性药物的全身神经毒性作用（见下图右上）。从尾部中部开始从近到远，可以看到明显的轴突损伤和轴突损失以及退化的神经纤维。在神经的Z远端部分，轴突变性非常严重，以至于只可见变性纤维的残余物，这与 NCS 实验可记录数据的缺失现象相匹配（见下图右下）。

图4. NCS检测数据及显微图像

综上所述，通过广泛的形态学表征证实，尾神经的神经生理学研究是评估轴突动物模型的可靠技术。当预期（或观察到的）实验结果与损伤严重性密切相关时更应考虑使用鼠尾检测神经损伤严重程度。因此，在未来的研究中，为尾中部可能被认为是检测轴突损伤的理想部位，轴突损伤的严重程度适当，既不像尾尖那么严重，也不像尾部基部那么轻微。

高衬度：低能量电子对有机分子产生更强烈的散射，具有更高对比度。

无需染色：突破以往生物/轻材料成像需要重金属染色的局限性。

高分辨率：无染色条件下能够达到1.0 nm的图像分辨率。

多模式：LVEM25能够在TEM、STEM模式中自由切换。

高效方便：真空准备只需要3分钟，空间小，环境需求低。

易操作且成本低：友好智能化操作界面，低耗材，低维护费用，无需专业操作人员。

图5. LVEM25成像实例 A：腺相关病毒 B：拟菌病毒 C：脂质体 D：成纤维细胞与细菌

图6. 有机纳米颗粒成像 左：80kV条件下成像 右：LVEM25成像